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基因编辑技术课堂实验教学方案

一、课程基本信息

*课程名称：基因编辑技术原理与实验操作

*课程性质：专业实验课/实践选修课

*面向对象：生命科学、生物技术、生物工程等相关专业高年级本科生或低年级研究生

*先修课程要求：分子生物学、遗传学、细胞生物学基础

*课程学时：理论讲授（若干学时）+实验操作（若干学时，可分模块进行）

*课程学分：（根据实际情况设定）

二、教学目标

（一）知识目标

1.掌握基因编辑技术的基本原理，特别是主流技术（如CRISPR-Cas9系统）的工作机制、关键组分及作用特点。

2.了解基因编辑技术的发展历程、主要类型（如ZFN、TALEN、CRISPR等）及其各自的优缺点与应用场景。

3.理解基因编辑实验设计的基本原则，包括sgRNA设计、载体构建策略、靶细胞选择、以及潜在脱靶效应的考量。

4.熟悉基因编辑后续检测与验证的常用方法及其原理，如PCR、限制性内切酶分析、测序验证等。

5.认识基因编辑技术在生命科学研究、医学、农业等领域的应用前景及所引发的伦理、法律和社会问题（ELSI）。

（二）技能目标

1.能够独立或在指导下设计针对特定靶基因的sgRNA序列，并利用生物信息学工具进行初步评估。

2.掌握基因编辑相关载体（如CRISPR-Cas9表达载体）的构建基本操作，如PCR扩增、酶切、连接、转化、质粒提取与鉴定等分子克隆技术。

3.掌握目的基因编辑效率的检测方法，如T7E1酶切分析、Surveyorassay或直接测序法进行Indel突变检测。

4.熟悉实验室常用仪器设备（如PCR仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台等）的规范操作。

5.培养实验设计能力、动手操作能力、数据分析与结果解读能力，以及实验记录的规范性。

6.提升团队协作意识、问题解决能力和科学探究精神。

（三）态度与价值观目标

1.培养严谨求实的科学态度和精益求精的实验作风。

2.增强生物安全意识和伦理责任感，严格遵守实验室操作规程。

3.激发对生命科学前沿技术的探索兴趣和创新思维。

三、教学内容与学时分配

（一）理论讲授部分(示例学时分配)

1.基因编辑技术概述与发展(1学时)

*基因编辑的概念与意义

*早期基因编辑技术简介（ZFN,TALEN）

*CRISPR-Cas9技术的发现与revolution

2.CRISPR-Cas9系统的分子机制(2学时)

*天然CRISPR-Cas系统的免疫防御机制（适应、表达、干扰）

*CRISPR-Cas9系统的核心组分：Cas9蛋白（结构与功能，如RuvC、HNH核酸酶结构域）、sgRNA（结构与功能，crRNA与tracrRNA）

*靶序列识别与切割机制（PAM序列的重要性）

3.sgRNA设计与载体系统(1.5学时)

*sgRNA设计原则与注意事项（特异性、GC含量、二级结构）

*常用sgRNA设计在线工具介绍

*CRISPR-Cas9表达载体类型（质粒载体、病毒载体、RNA/蛋白递送）

*报告基因与筛选标记的应用

4.基因编辑实验流程与关键技术(2学时)

*细胞培养与转染技术（脂质体法、电穿孔法等）

*基因编辑效率检测方法（T7E1assay,Surveyorassay,测序法（Sanger测序、NGS），荧光报告系统）

*基因编辑的衍生应用（基因敲除、基因敲入、碱基编辑、PrimeEditing等简介）

5.基因编辑的脱靶效应与优化策略(1学时)

*脱靶效应的产生原因与影响

*脱靶效应的检测方法

*提高特异性的策略（高保真Cas9变体、sgRNA优化、递送方式改进）

6.基因编辑的应用与伦理规范(0.5学时)

*在基础研究、疾病治疗、农业育种等领域的应用案例

*伦理、法律与社会问题（ELSI）讨论

（二）实验操作部分(示例模块与学时，可根据实际条件组合或调整)

*模块一：sgRNA设计与表达载体构建(约3-4学时，可分2次进行)

*实验内容：

1.目标基因选择与序列获取（如模式生物中的某个报告基因或内源基因）。

2.利用在线工具设计并评估sgRNA序列。

3.sgRNA表达cassette的获取（PCR扩增或退火合成寡核苷酸链）。

4.载体酶切与纯化。

5.sgRNA片段与载体的连接反应。

6.感受态细胞转化与阳性克隆筛选（菌落PCR或质粒提取后酶切鉴定）。

7.阳性克隆的测序验证。

*技能点：生物信息学工具使用、PCR、限制性内切酶操作、DNA连接、细菌转化、质粒提取、琼脂