DB21∕T 2548-2015 种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2548—2015

种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程

MethodofPCR-RELPfordetectinghalothanegenotypeinswine

2015—12—15发布2016—02—15实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2548—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009标准给出的规则制定。

附录A、附录B和附录C均为规范性附录。

本标准由辽宁医学院提出。

本标准由锦州市质量技术监督局归口。

本标准起草单位：辽宁医学院。

本标准主要起草人：苏玉虹、田玉民、朱弘焱、李立山、王立辛、王希。

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种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程

1范围

本标准规定了种猪氟烷基因的PCR-RFLP（聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性）检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。

本标准适用于种猪氟烷基因的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则

3术语和定义

3.1

氟烷基因halothanegene

即兰尼定受体1(RyanodineReceptor1,RYR1)基因，定位于猪6号染色体6p1.2，在基因序列数据库（GenBbank）中的登录号为X69465.1，全长29699bp，mRNA为15378bp。该基因编码骨骼肌钙离子释放通道蛋白，是猪应激综合征（PorcineStressSyndrome,PSS）的主效基因。

4防污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2第七章规定执行。

5安全防护

实验室安全防护按GB/T27476.1第五章规定执行。

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6检测条件

6.1实验室条件

按GB/T19495.2中的规定执行。

6.2扩增种猪氟烷基因片段的PCR引物

——上游引物F：5′TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA3′

——下游引物R：5′TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG3′。

6.3主要试剂

水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。

裂解液、10%SDS、饱和酚、TE缓冲液、TBE缓冲液、上样缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、2×PfuPCRMasterMix、限制性内切酶HhaI及10×M酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标准品等。具体配制方法参见附录A。

6.4主要仪器

微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、精度0.1g分析天平、恒温金属浴、涡旋混合仪。

7检测步骤

7.1样品的采集

用猪耳号钳子夹取种猪耳部边缘组织0.5cm3，立即置于装有75%乙醇的1.5mLEp白色塑料管中，-20℃保存备用。

7.2种猪基因组DNA提取

采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。

7.3PCR扩增及其产物检测

15μL反应体系：0.05μg/μL～0.1μg/μL待测DNA1μL、20μmol/L上下游引物各1μL、2×PfuPCRMasterMix7.5μL、灭菌双蒸水4.5μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。

PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

取2μLPCR产物和2μLDNA分子质量标准品（100bpDNAMarker），2%琼脂糖凝胶（溴化乙锭

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（EB）溶液染色）电泳20min～30min（2V/cm～3V/cm），在凝胶成像系统观察条带。PC