DB13T 2609-2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重RT -PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30

B41DB13

河北省地方标准

DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR

检测方法

2017-11-22发布2017-12-22实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T2609—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、李丽敏、白云、韩庆安。

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DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EB:溴化乙锭(ethidiumbromide)

DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)

PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)

dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)

3试剂或材料

包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准(100bp),2×TaqMasterMix。

警示：氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。

3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。

3.2氯仿：又名三氯甲烷。

3.31.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

3.5溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。

3.6焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。

3.7DNA分子量标准(100bp):包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。

3.8反转录酶：M-MLV反转录酶(200U/μL)或AMV反转录酶(10U/μL)。

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DB13/T2609—2017

3.9RNA酶抑制剂。

3.102×TaqMasterMix:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

3.11dNTP。浓度为2.5mM。

3.12引物：反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

4仪器设备

4.1PCR仪：温度范围4.0℃~99.9℃,样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。

4.2凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1ng;有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。

4.3台式低温高速离心机：最高转速16000r/min;容量1.5mL×12。

4.4电泳仪：电压50V～120V,电流10mA～800mA,定时0min～999min。

4.5电泳槽