DB21∕T 2549-2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2549—2015

仔猪乳糖酶基因检测技术规程

Methodofdetectinglactasegeneinpiglets

2015—12—15发布2016—02—15实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2549—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009标准给出的规则制定。

附录A、附录B和附录C均为规范性附录。

本标准由辽宁医学院提出。

本标准由锦州市质量技术监督局归口。

本标准起草单位：辽宁医学院。

本标准主要起草人：田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓丽、王希。

DB21/T2549—2015

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仔猪乳糖酶基因检测技术规程

1范围

本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。

本标准适用于仔猪乳糖酶基因检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则

3术语和定义3.1

乳糖酶基因Lactasegene,LCT

乳糖酶（LCT）又称β-半乳糖苷酶，在特定条件下将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，进而被消化道吸收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13，预测CDS全长为5793bp，在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为XM_003359430。

4防污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2第七章规定执行。

5安全防护

实验室安全防护按GB/T27476.1第五章规定执行。

6检测条件

6.1实验室条件

按GB/T19495.2中的规定执行。

6.2扩增仔猪乳糖酶基因片段的PCR引物

DB21/T2549—2015

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扩增启动子SNPG-308C和A-301G片段的PCR引物：

——上游引物F：5-AAAAAGTTTGGTAAGGACCT-3；

——下游引物R：5-GGAACTGTTAGGAGGTATGTG-3

扩增增强子SNPG-797A片段的PCR引物：

——上游引物F：5-TAAACAAAGCCAAGGACATT-3；

——下游引物R：5-CTGGGGTGTATGTGCTTGTGG-3

6.3主要试剂

用水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。

裂解液、10%SDS、饱和酚、TE缓冲液、2×PfuPCRMasterMix、蛋白酶K、凝胶回收纯化试剂盒、测序试剂盒等。具体配制方法参见附录A。

6.4主要仪器

微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1g分析天平、涡旋混合仪、电泳仪、全自动DNA测序仪等。

7检测步骤

7.1样品的采集

用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5cm3，立即置于装有75%乙醇的1.5mLEp白色塑料管中，

-20℃保存备用。

7.2仔猪基因组DNA提取

采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。

7.3乳糖酶基因5UTR区启动子SNPG-308C和A-301G的检测

15μL反应体系：DNA模板50ng、10μmol/L上下游引物各1μL、2×PfuPCRMasterMix7.5μL、加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为318bp。

PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0测序试剂盒对PCR产物