DB21T 2742-2017 饲料中动物源性成分-貂源性组织成分定性检测方法PCR 方法.docxVIP

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DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2742—2017

饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定

性检测方法PCR方法

AnimalderivedingredientsinFeed-qualitativedetectionofminktissuederivedingredientswithPCRmethod

2017-02-23发布2017-03-23实施

辽宁省质量技术监督局发布

I

DB21/T2742—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。

本标准由辽宁省质量技术监督局归口。

本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。

本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

DB21/T2742—2017

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饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法

1范围

本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。

本方法的貂源性成分检测限为0.5%（w/w）。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T19495转基因产品检测

GB/T20195动物饲料试样的制备

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3原理

利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。

4试剂和材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。

4.1引物

根据Primer6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为：

F：5’-TTAGTAGCTCATAACGCCTTG-3’

R：5’-CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG-3’

根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。

4.2BstXⅠ限制性内切酶。

4.3PCRMastermix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。

4.4基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。

4.5裂解缓冲液：250mmol/LSDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。

DB21/T2742—2017

2

4.6TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。

4.7胶回收试剂盒或其他替代试剂。

4.8电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。

4.9琼脂糖：分子生物学级别。

4.10溴化乙锭贮存液（10mg/mL）或荧光染料替代品。

4.11DNA分子量标准品（100bp-1000bp）。

5仪器设备

5.1分析天平：感量为0.01g和0.0001g。

5.2台式离心机：离心力12000r/min。

5.3水浴锅：温度可调范围为28℃-95℃,误差为±0.5℃。

5.4PCR仪。

5.5电泳仪。

5.6凝胶成像仪。

5.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（可测量微量样品）。

6测定程序

饲料中貂源性成分测定程序见图1。

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试样

配合饲料浓缩饲料肉骨粉饲料单一饲料

磨碎、过筛

DNA提取

DNA浓度及纯度测定

PCR扩增及电泳检测

酶切及电泳检测

PCR

图1饲料中貂源性成分测定程序图

7操作步骤

7.1制样

按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，取有代表性的