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免疫印迹实验操作规范与注意事项

免疫印迹技术，常被称作WesternBlot，作为生命科学研究中一种常用且强大的蛋白质分析手段，其原理是基于抗原抗体的特异性结合，将复杂混合物中的目标蛋白进行分离并定性或半定量检测。这项技术的成功应用，不仅依赖于对基本原理的深刻理解，更取决于操作过程中的每一个细节是否规范、严谨。一个看似微不足道的疏忽，都可能导致整个实验结果的偏差甚至失败。因此，建立一套标准化的操作流程并严格遵守，同时时刻关注那些易被忽略的关键节点，对于获得可靠、可重复的实验数据至关重要。

一、实验前准备与试剂配制

实验的成功与否，很大程度上取决于前期准备工作的充分程度。在开始动手操作之前，务必对实验方案进行细致的梳理，确保每一步都了然于胸。

试剂配制是实验准备的核心环节。所有用于WesternBlot的试剂，其纯度和浓度都必须严格符合实验要求。缓冲液的配制应使用高纯度的去离子水，最好是双蒸水或超纯水，以避免杂质干扰。配制过程中，各种溶质的称量要精确，充分溶解后需调整至合适的pH值，这一点对于电泳和转膜缓冲液尤为关键，pH的微小偏差都可能显著影响实验结果。配好的缓冲液应清晰标记名称、浓度、配制日期，并根据其性质妥善保存，有些需要室温避光，有些则需4℃冷藏，甚至分装后-20℃冻存。特别需要注意的是，含SDS的缓冲液在低温下可能会出现沉淀，使用前需确认其是否溶解完全，必要时可水浴加热助溶。

实验材料与耗材的准备同样不可小觑。凝胶制备所需的玻璃板、梳子应保持洁净无划痕，必要时用专用清洁剂清洗并彻底冲洗干净，避免残留物质影响凝胶聚合。PVDF膜或硝酸纤维素膜（NC膜）应根据目标蛋白的分子量大小和实验需求进行选择，并在取用前检查包装是否完好，避免污染。其他如滤纸、海绵垫、离心管、移液器吸头等耗材，需确保无菌、无酶、无污染。若使用一次性手套，应选择无粉手套，或在使用前将滑石粉冲洗干净，以防粉末污染膜和凝胶。

二、样品制备：蛋白质提取与定量

样品制备是WesternBlot的起始步骤，也是保证后续实验成功的物质基础，其目标是获得高纯度、高活性且浓度适宜的蛋白质样品。

蛋白质提取的关键在于根据样品类型（如细胞、组织、细菌等）选择合适的裂解液。裂解液中通常含有去污剂（如SDS、TritonX-100）以破坏细胞膜，盐离子以维持渗透压，以及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（根据实验需求）以防止目标蛋白的降解和去磷酸化。在操作过程中，应尽可能保持低温环境，例如在冰上操作，使用预冷的裂解液和离心管，以降低蛋白酶活性。对于组织样品，需进行充分的匀浆；对于贴壁细胞，需先进行温和的消化或刮取，避免过度机械损伤导致蛋白降解。细胞或组织裂解后，通过离心（通常为12,000g左右，4℃，一定时间）去除细胞碎片和未裂解的物质，上清液即为粗提的蛋白样品。

蛋白质定量是确保上样量均一的前提，对于实验结果的准确性和重复性至关重要。常用的定量方法有BCA法、Bradford法等，各有其特点和适用范围。无论采用何种方法，都应严格按照试剂盒说明书进行操作，标准品的稀释应准确无误，样品也需根据预期浓度进行适当稀释，以确保其测定值落在标准曲线的线性范围内。每个样品建议设置复孔，以减少测定误差。定量完成后，根据目标浓度和上样体积，计算所需样品体积，并加入适量的上样缓冲液（如5×或2×SDS上样缓冲液），充分混匀。

样品变性通常是上样前的最后一步。将加有上样缓冲液的样品进行煮沸处理（一般为95-100℃，5-10分钟），使蛋白质充分变性解聚为单链，并与SDS充分结合，带上负电荷。对于某些热稳定性较差或容易形成多聚体的蛋白，煮沸时间和温度可能需要适当调整。煮沸后应立即置于冰上冷却，然后短暂离心，使管盖和管壁上的液滴沉至管底，即可准备上样。

三、电泳分离：凝胶制备与蛋白分离

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是WesternBlot中分离蛋白质的核心步骤，其原理是基于蛋白质分子量的差异实现分离。

凝胶制备需要在洁净的制胶板中进行。首先根据目标蛋白的分子量范围选择合适浓度的分离胶。一般来说，低浓度凝胶（如8%）适合分离大分子蛋白，高浓度凝胶（如12%、15%）适合分离小分子蛋白。分离胶溶液按配方依次加入各组分（丙烯酰胺单体、分离胶缓冲液、去离子水、SDS、APS、TEMED），需注意APS和TEMED是引发剂和加速剂，应在灌胶前最后加入，并轻轻混匀，避免产生气泡。将分离胶溶液缓慢注入制胶板中，留出浓缩胶的空间，并在胶面上覆盖一层水或异丙醇以隔绝空气，促进凝胶聚合，并使胶面平整。待分离胶完全聚合（通常需要30分钟至1小时，可通过观察水层与胶面之间的清晰界面判断），倾去上层覆盖液，用去离子水冲洗胶面数次，吸干残留水分。随后配制浓缩胶，按配方混合各组分，注入分离胶上方，插入梳子，注意避免产生