细胞生物学第十四章细胞工程上课讲课文档.pptVIP

细胞生物学第十四章细胞工程上课课件;（优选）细胞生物学第十四章细胞工程上课课件;第一节主要相关技术;1）微载体（microcarrier）

基质材料：交联葡聚糖

1g交联葡聚糖提供6000cm2附着面积

微载体是大规模培养方法中最有使用价值的支持物。;2）中空纤维（hollowfiber）

管壁半透性，细胞附于管外壁，管内可供培养液通过。

有利于分泌型表达蛋白的纯化，但不易放大培养。;3、抑制细胞的凋亡;（二）基本培养系统;2.气流驱动培养系统;细胞的基本生长特征：;优化大规模细胞培养的营养量化评估指标：

1）考虑细胞密度、生存能力、有丝分裂指数、一般形态及破碎数量的信息；

2）采用检测生化指标来判断。

葡萄糖和乳酸盐的浓度可以反映培养液的质量情况；乳酸脱氢酶可以判断细胞损伤或破碎情况。;利用显微注射装置，将一个细胞的核移植入另一个去核细胞中，已得到重组细胞。是克隆的关键技术。;第十二页，共38页。;（一）技术路线;3.去核：

（1）紫外线照射去核

通过破坏DNA去核。损伤较大，基本弃用。

（2）盲吸法去核

依据MII期卵母细胞中第一极体与细胞核的对位关系，用去核针吸去第一极体及其附近胞质，成功率约80%。;第十五页，共38页。;（3）蔗糖高渗处理去核法

先经高渗蔗糖（0.3~0.9mol/L）处理，使核微凸，以去核针去除。

（4）透明带打孔去核法

先以显微针在透明带打孔，以细胞松弛素处理后去核，提高卵母细胞存活率。

（5）超速离心法;4.重构胚的构建：

直接将供核细胞移植到MII期卵母细胞/受精卵透明带下，经细胞融合实现重组—已应用于多种家畜。

取供核细胞核直接注入已去核的受体细胞质—多用于克隆小鼠。;5.重构胚的激活

（1）化学激活

（2）电激活

处理后能够卵裂则表明激活成功。;（二）不同供核细胞的核移植;MeganMoragfromEnglish;2.体细胞核移植：;体细胞核移植的成功，证明高度分化的成体细胞核仍具发育全能性，能在成熟卵母细胞中实现重编程，发育为完整个体。

MII期的卵母细胞中含大量MPF，可诱导供体核发生一系列早熟变化，尤其???使S期细胞核出现染色体异常，对G1期染色体损害较小。

选取G0或G1期细胞为核供体，选MPF水平低时的卵母细胞为受体。;三、基因转移;（1）电穿孔法：以脉冲电场使细胞膜产生细小空洞，使外源DNA进入细胞质。

（2）显微注射法：将DNA直接注入细胞，多用于制备转基因动物。

优点：不含病毒基因组片段

缺点：基因随机整合于染色体，易导致受体细胞基因灭活或转化基因不表达。;2.化学转化法;通过病毒感染的方式导入外源基因。

病毒载体为缺陷型病毒，感染后将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。

常用：腺病毒载体、逆转录病毒载体。

;第二十七页，共38页。;第二节动物细胞工程的应用;单克隆抗体制备技术（B淋巴细胞杂交瘤技术）：将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞，用于制备单克隆抗体。

所获得的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞无限生长的特性，又具有B淋巴细胞分泌抗体的能力。;单克隆抗体的制备过程;由于微生物缺乏蛋白质翻译后的加工修饰系统，因此许多复杂人体蛋白必须用真核动物细胞表达。如：

溶血栓药物--组织型纤溶酶原激活剂（tPA）

血友病药物—凝血因子VIII

促红细胞生成素—治疗肿瘤化疗或肾脏疾病导致的红细胞减少症;二.基因工程动物的产生;1、疾病动物模型

目前已有多种遗传疾病的模型小鼠，是研究人类疾病的有利工具。;第三十四页，共38页。;第三十五页，共38页。;第三十六页，共38页。;第三十七页，共38页。;谢谢大家！