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演讲人：日期:检验科细菌培养技术操作规范

CATALOGUE目录01样品采集规范02培养基准备标准03培养操作步骤04细菌鉴定方法05质量控制要点06安全与维护

01样品采集规范

无菌采样技术采样前需对采样部位及周围环境进行彻底消毒，使用75%酒精或碘伏擦拭，避免环境微生物污染样本。严格消毒操作必须采用一次性无菌采样拭子、注射器或容器，确保器械无污染，采样过程中避免接触非目标区域。采样人员需佩戴无菌手套，不同样本间更换器械，防止患者间或环境微生物交叉污染。无菌器械使用根据样本类型（如血液、尿液、分泌物）选择合适采样方法，如静脉穿刺需避开皮肤定植菌，深部痰液需咳出后立即收集。规范采样流免交叉污染

样品标识与记录推荐使用LIS（实验室信息系统）录入样本数据，实现全流程数字化追踪，减少人为记录误差。电子化管理系统采样后需由两名工作人员核对样本信息与申请单一致性，避免标签错误或信息遗漏。双人核对机制记录患者临床症状、疑似诊断、抗生素使用情况等关键信息，为实验室分析提供参考依据。临床信息完整性每个样本需标注患者姓名、编号、采样部位及类型，采用防水标签或电子条码，确保信息清晰可追溯。唯一性标识

根据样本类型选择厌氧罐、血培养瓶或无菌密封容器，确保运输过程中无泄漏或气体交换。适宜容器选择对温度敏感样本（如脑脊液）需使用恒温运输箱，配备温度记录仪，确保全程符合保存条件。温度监菌培养样本需在采样后2小时内送达实验室，若延迟需采用专用转运培养基或冷藏（4℃）保存，但不超过24小时。时效性控制高致病性样本需使用三层包装（主容器+吸水材料+外包装），标注生物危害标识，符合UN2814运输标准。生物安全防护运输与保存要求

02培养基准备标准

培养基类型选择差异化培养基配置苛养菌（如流感嗜血杆菌）需补充特殊因子（如X因子、V因子）或使用巧克力琼脂等富集培养基，确保其生长所需的复杂营养环境。选择性培养基应用针对特定病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）需采用含抑制剂的选择性培养基（如SS琼脂、麦康凯琼脂），抑制杂菌生长以提高目标菌检出率。通用培养基选择需根据目标菌种的营养需求选择基础培养基（如营养琼脂、血琼脂），适用于大多数细菌的分离培养，支持非苛养菌的基础生长条件。

配制与灭菌流程高压灭菌参数控制采用121℃、15psi高压蒸汽灭菌15-20分钟，灭菌后需缓慢降压以防液体沸腾溢出，冷却至50℃左右方可添加热敏感成分（如血液、抗生素）。分装与容器处理分装至无菌培养皿或试管前需检查容器洁净度，避免残留污染物；分装量需符合标准（如平板厚度3-4mm），防止干燥或溢漏。精确称量与溶解严格按照配方比例称量培养基干粉，使用纯化水溶解并充分搅拌，避免结块或成分分布不均，确保培养基成分的均一性。

无菌性验证接种标准菌株（如大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923），评估培养基支持目标菌生长的能力，包括菌落形态、大小及色素是否符合预期。生长性能测试理化特性检查测定培养基pH值（误差范围±0.2）、湿度及凝固状态，避免因pH偏移或过度干燥影响细菌生长，必要时进行批次间稳定性比对。随机抽取灭菌后的培养基置于35℃培养箱中孵育24-48小时，观察是否有杂菌污染，确保灭菌过程的有效性。质量检测方法

03培养操作步骤

接种过程需在生物安全柜内完成，操作者需穿戴无菌手套、口罩及防护服，避免环境微生物污染样本。接种环或接种针需火焰灭菌后使用，确保每次操作前无残留细菌。接种技术规范无菌操作要求采用四区或三区划线法分离细菌，第一区密集划线以获取单菌落，后续区域逐步稀释样本浓度，提高分离纯化效果。操作时需控制划线力度，避免划破培养基表面。分区划线法将样本均匀混入液体培养基时，需避免剧烈震荡导致气泡产生，影响细菌生长环境。接种后需立即密封瓶口，防止外界污染或培养基蒸发。液体培养基接种

培养条件控制根据不同细菌种类设定培养箱温度（如35±2℃为常见致病菌培养条件），湿度需维持在60%-70%以防止培养基脱水。厌氧菌培养需使用专用厌氧罐或工作站，确保氧气浓度低于1%。温度与湿度调控需氧菌培养需保证充足氧气供应，微需氧菌则需调节二氧化碳浓度为5%-10%。培养箱内气体成分需定期校准，避免因设备误差导致培养失败。气体环境管理针对目标细菌选择选择性培养基（如麦康凯琼脂分离肠道菌）或非选择性培养基（如血琼脂培养苛养菌）。每批次培养基需进行无菌试验和性能验证，确保无污染且支持细菌生长。培养基选择与质量控制

定时观察频率培养初期每8-12小时观察一次菌落形态、颜色及溶血现象，记录生长速度。对于缓慢生长的细菌（如结核分枝杆菌），可延长观察周期至48-72小时，但需避免频繁开箱影响培养环境。生长观察记录菌落特征描述详细记录菌落大小（针尖状、中等、扩散型）、