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二甲双胍对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

摘要

本研究旨在探究二甲双胍对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响及其潜在机制。通过体外分离培养大鼠BMSCs并进行骨向诱导分化，实验组添加不同浓度二甲双胍。运用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测细胞增殖，碱性磷酸酶（ALP）活性分析、矿化结节定量、实时定量RT-PCR检测细胞骨向分化情况。结果显示，一定浓度二甲双胍可促进BMSCs增殖，提高ALP活性，增加矿化结节形成，上调成骨特异性基因表达。表明二甲双胍对体外培养的骨向分化骨髓基质细胞具有促增殖、促分化作用，其机制可能与激活相关信号通路有关，为骨组织工程及相关骨疾病治疗提供了新的思路和实验依据。

关键词

二甲双胍；骨髓基质干细胞；成骨分化

一、引言

骨髓基质干细胞（BoneMarrowStromalCells，BMSCs）是一类存在于骨髓中的多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在适宜条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型。由于其在骨组织工程、骨质疏松症等骨相关疾病治疗方面展现出的巨大潜力，BMSCs成为了研究热点。

二甲双胍作为经典的口服降糖药物，广泛应用于2型糖尿病的治疗。近年来研究发现，二甲双胍除降糖作用外，在心血管疾病、肿瘤预防等方面也具有潜在益处。尤其值得关注的是，越来越多证据表明二甲双胍对骨代谢存在影响。有研究显示，二甲双胍可提高骨质疏松动物模型的骨密度，防止骨量丢失；还能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，抑制其成脂分化。然而，二甲双胍对大鼠BMSCs成骨分化影响的具体机制尚未完全明确。因此，深入探究二甲双胍对大鼠BMSCs成骨分化的作用及其机制，对于拓展二甲双胍在骨相关领域的应用具有重要意义。

二、材料与方法

2.1实验动物及主要试剂、仪器

健康成年SD大鼠，体重200-250g，购自[动物供应商名称]。二甲双胍（纯度≥98%）购自[试剂公司名称]；α-MEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自[生物公司名称]；碱性磷酸酶检测试剂盒、茜素红染色试剂盒购自[生化试剂公司名称]；实时定量RT-PCR相关试剂购自[分子生物学试剂公司名称]。CO?培养箱（[品牌及型号]）、酶标仪（[品牌及型号]）、PCR仪（[品牌及型号]）等。

2.2大鼠骨髓基质干细胞的分离与培养

将SD大鼠脱颈椎处死后，置于超净工作台中。用75%酒精消毒大鼠全身，迅速取出双侧股骨和胫骨，剔除附着的肌肉和结缔组织。用含10%FBS的α-MEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液于离心管中。1000r/min离心5min，弃上清，加入适量含10%FBS的α-MEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。24h后首次换液，去除未贴壁细胞，之后每2-3天换液一次，待细胞融合至80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.3实验分组及处理

取第3代生长状态良好的BMSCs，调整细胞密度为5×10?个/mL，接种于96孔板、24孔板及6孔板中。实验分为空白对照组和二甲双胍实验组，实验组分别添加终浓度为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的二甲双胍。每组设置6个复孔。

2.4MTT法检测细胞增殖

将接种于96孔板的细胞培养1、3、5、7d后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。小心吸去上清，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。用酶标仪在490nm波长处检测各孔吸光度（OD值），以OD值表示细胞增殖情况。

2.5碱性磷酸酶（ALP）活性分析

细胞接种于24孔板，培养至第7d时，弃去培养液，用PBS冲洗2次。每孔加入100μL细胞裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min离心15min，取上清。按照ALP检测试剂盒说明书操作，检测上清中ALP活性，以每毫克蛋白中ALP的活性单位表示结果。同时，对细胞进行ALP染色，观察细胞内ALP表达情况。

2.6矿化结节定量

细胞接种于6孔板，培养至第21d时，弃去培养液，PBS冲洗3次。用4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗后，加入茜素红染色液染色30min。用PBS冲洗去除多余染色液，倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。用10%cetylpyridiniumchloride溶液溶解矿化结节中的钙盐，振荡1h。取上清于96孔板，用酶标仪在562nm波长处检测吸光度，以吸光度值表示矿化结