分子生物学讨论课讨论题.pptVIP

讨论题目：已知目的基因的cDNA序列（GenBank登录号：AK135903.1），拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。当前第1页\共有30页\编于星期五\3点

根据133-1941的序列，设计PCR引物从cDNA中扩增该序列得到扩增产物后将产物插入质粒该质粒扩增后转染哺乳动物细胞，纯化后进行表达1234我们的方案：当前第2页\共有30页\编于星期五\3点

根据133-1941的序列，设计PCR引物当前第3页\共有30页\编于星期五\3点

引物设计目的、原理及原则1搜索、设计引物3学习使用GenBank2根据原则筛选引物4当前第4页\共有30页\编于星期五\3点

引物设计的目的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。引物设计的原理1、择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。?2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。?3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。?4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为40～60％。?5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。?6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3’末端的互补。当前第5页\共有30页\编于星期五\3点

引物的设计原则（详见课本P.164）①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。当前第6页\共有30页\编于星期五\3点

GenBank是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区（CDS）特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织，包括EMBL和DDBJ。可使用它找到靶序列。当前第7页\共有30页\编于星期五\3点

1.从/nuccore/网站中对该基因进行搜索，输入登录号：AK135903.1当前第8页\共有30页\编于星期五\3点

2.查询可知其序列为当前第9页\共有30页\编于星期五\3点

3.直接在genbank中得到的引物序列结果pair3、pair5的3端有三个连续的碱基，舍去。pair1的3端末尾有碱基A，舍去。当前第10页\共有30页\编于星期五\3点

pair6，pair7的3端末尾是碱基A，舍去。所以，可用的引物序列为：pair2、pair4当前第11页\共有30页\编于星期五\3点

搜索引物当前第12页\共有30页\编于星期五\3点

当前第13页\共有30页\编于星期五\3点

点击getprimers后得到不同的引物方案当前第14页\共有30页\编于星期五\3点

从cDNA中扩增该序列当前第15页\共有30页\编于星期五\3点

（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA?2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl；?

?（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心；?

?（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；?

?（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；?

?（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。一、PCR当前第16页\共有30页\编于星期五\3点

主要原料模板DNATaqDNA聚合酶引物（提前设计并合成与目的DNA两侧互补的引物，琼脂糖凝胶电泳，分离和纯化PCR产物-）二、利用PCR技术扩增目的基因当前第17页\共有30页\编于星期五\3点

得到扩增产物后将产物插入质粒当前第18页\共有30页\编于星期五\3点

真核表达载体质粒的复制起始位点便于筛选重组质粒的抗生素抗