蛋白亲层析色谱法操作.pdfVIP

方法：

在中性环境中，lgG类的免疫球蛋白能特异性地与色谱柱中装载的蛋白A相结合，此时非

特异性结合的其他物质的亲和力远小于IgG，通过简单的可以将其他物质洗脱下来；

然后改变流动相的pH，使IgG在酸性条件下被洗脱下来。根据蛋白在280nm有明显吸收

的特点，以流通池检测的IgG吸光度对样品进行定量。

适用范围：

适用于本公司B项目产品研发过程中IgG表达量的定量分析，包括发酵工序、纯化工序等

中间产品的含量分析和原液、成品的含量分析。

职责：

操作人员：

严格按照此规程要求进行操作。

岗位主管：

起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；

监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；

培训，确保此操作规程的正确实施。

程序：

1术语解释

1.1供试品保留时间偏移比例：每个序列中供试品的保留时间与同序列中质控样品的保留时间

之差与质控样品的保留时间的比值。

2仪器设备

2.1色谱柱：POROSProteinA(2.1mm×3cm)，AppliedBiosystems，货号：2-1001-00。

2.2高效液相色谱仪：Agilent1260Infinity。

3试剂

3.1KH2PO4（色谱纯）；KOH（色谱纯)；NaCl（色谱纯）；HCl（分析纯）；超纯水（）。

4溶液配制

4.1流动相配制

4.1.1Loadingbuffer（10mMPBS，150mMNaCl，pH7.2）

称取NaCl8.8g，KH2PO41.36g，溶解于950ml超纯水中；用KOH调整pH至7.2±0.02，

超纯水定容至1L；复核并确认pH在7.2±0.02范围内，记录最终pH。使用0.45μm滤器

过滤并超声脱气15分钟，可直接使用。若需，则放置2-8℃低温，在1个月内

使用。使用前需要重新确认pH值，且进行脱气处理。

4.1.2Elutionbuffer（150mMNaCl，pH2.6）

称取NaCl8.8g溶解于950ml超纯水中，使用HCl调整pH至2.6±0.02，超纯水定容至

1L；复核并确认pH在2.6±0.02范围内，记录最终pH。使用0.45μm滤器过滤并超声脱

气15分钟，可直接使用。若需，则放置2-8℃低温，在1个月内使用。使用前

需要重新确认pH值，且进行脱气处理。

Method

summary:

Inaneutralenvironment,IgG-typeimmunoglobulinscanspecificallybindtoproteinAloadedinthe

chromatographiccolumn.Atthistime,theaffinityofothernon-specificbindingsubstancesismuchsmallerthan

thatofIgG.Othersubstancescanbeelutedthroughsimplecleaning;thenchangethepHofthemobilephasesothat

IgGiselutedunderacidicconditions.Accordingtotheobviousabsorptioncharacteristicsofproteinat280nm,the

samplewasquantifiedbytheIgGabsorbancedetectedbytheflowcell.

Scopeof

application:

Itissuitablefor