常见的生化与分子生物学技术兼容版.pptVIP

影响杂交的因素浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢核酸分子的浓度和长度：单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂交效率DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃2、温度：01低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加02高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度3、离子强度：01甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交02如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交4、甲酰胺：01核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性02035、核酸分子的复杂性：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉6、非特异性杂交反应：标记前后探针基本结构、化学性质相同;操作简单、节时；特异性强、本底低、重复性好；安全、无环境污染。一个理想的标记物应满足：Northern印迹与Southern印迹的不同点变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理靶核酸为RNA基因组DNA探针22%RNA探针40%cDNA探针38%一、探针的种类寡核苷酸探针68%探针的标记探针的选择在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交核酸分子杂交实验因素的优化选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定；1一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高3但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等2在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统4探针的标记方法五、核酸分子杂交实验因素的优化总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加01在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加02膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml03受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响04探针的浓度五、核酸分子杂交实验因素的优化五、核酸分子杂交实验因素的优化杂交率现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形t1/2=ln2/kct1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s）k=形成杂交体的速率常数[mol/(Lxntxs)]决定于探针长度（L）、探针复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和pHc=溶液中的探针浓度（mol/L）01020304杂交最适温度——杂交技术最重要的因素之一最适复性温度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：Tor=Tm–25℃反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱苛刻复性温度：Ts=Tm–(10或15℃)05非苛刻复性温度：Tns=Tm–(30或35℃)五、核酸分子杂交实验因素的优化杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交最佳通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶DNA和非特异靶DNA（如鱼精或大肠杆菌DNA）