T_JAASS 149-2024 畜禽产品中三类致病菌(单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌)梯型熔解温度等温扩增技术规范.docxVIP

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团体

JAASS

标准

T/JAASS149—2024

畜禽产品中三类致病菌(单核细胞增生李斯

特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌)梯型熔

解温度等温扩增技术规范

Technicalspecificationforladder-shapemeltingtemperatureisothermal

amplificationofthreepathogenicbacteria(Listeriamonocytogenes,Salmonella,

Clostridiumperfringensin)livestockandpoultryproducts

2024-06-24发布2024-07-24实施

江苏省农学会发布

I

T/JAASS149—2024

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4生物安全措施 1

5原理 1

6试剂和材料 1

7主要仪器和设备 2

8操作步骤 2

9致病菌检测结果判定 3

10质量控制 3

附录A（资料性）单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌靶基因序列 4

II

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由江苏省农业科学院提出。

本文件由江苏省农学会归口。

本文件起草单位：江苏省农业科学院、许昌学院。

本文件主要起草人：张辉、王德国、包红朵、吴立婷、张永清、周艳。

T/JAASS149—2024

1

畜禽产品中三类致病菌(单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气

荚膜梭菌)梯型熔解温度等温扩增技术规范

1范围

本文件规定了畜禽产品中三类致病菌单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella）和产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的梯型熔解温度等温扩增检测方法和操作规范。

本文件适用于畜禽产品中上述三类致病菌的核酸定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4生物安全措施

工作人员应具备微生物相关资质，所有使用过的培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。

5原理

选择Tm值曲线为梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特异性核酸片段为靶序列设计巢式引物，将巢式引物的外引物与内引物分别连接成一对引物作为等温扩增用引物，借助外引物与核酸靶序列上对应片段的熔解温度差异提供单链模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通过合成反应与链替代反应对梯型Tm值曲线的靶标核酸片段进行等温扩增，进行不同致病菌的定性分析技术。

6试剂和材料

6.1DNA提取试剂盒。

6.2实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

6.3Tris-HCl；乙二胺四乙酸（EDTA）；异硫氰酸胍；TritonX-100；异丙醇；TE溶液（pH8.0）；氯仿；异戊醇；TaqDNA聚合酶；BstDNAPolymerase；甜菜碱（Betaine）；dNTPs；MgSO4；BstDNAPolymeraseBuffer；SYBRGreenⅠ。

6.4致病菌特异性引物：根据单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌特异性核苷酸序列（参见附录A)设计的内、外引物及环状引物。

6.4.1单核细胞增生李斯特氏菌

Lm-FIP:5,-TGATGTTGGTGTTGCGTTTTGGGCA-

ATTAACAGGCGATAACT-3,

Lm-BIP:5,-CAGGAGGCGGCGGTTTTTCCAGTTG-

TCCCTTCTCCACC-3,

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2

Lm-LF:5,-CGATTTCTTGTTTAATGA-3,

6.4.2沙门氏菌

Sa-