第3章蛋白质的分离.ppt

第一节蛋白质分离纯化概述;一、蛋白质分离纯化的一般程序;对于任何一个特定的蛋白质，纯化方案细节的确定都有赖于一系列的因素，，这些因素包括：

1.正确选择原材料和定位目的蛋白（胞内或胞外）；

2.目的蛋白的表达水平；

3.蛋白质的理化性质；

4.纯化的目的。;一、蛋白质分离纯化的一般程序;二、蛋白质纯化方法分类;■各种纯化或分析方法的原理：;■各种纯化方法的应用次序：;三、蛋白质分离纯化中的注意事项：;尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性;第二节材料的选择与处理;一、材料的选择;■目标材料的选择：;SP蛋白质表現(马铃薯各组织);材料的选择原则：;二、材料的处理;1.动物材料的处理;2.植物材料的处理;■植物色素的产生及去除：;3.微生物材料的处理;三、细胞破碎方法;1机械破碎;2物理破碎;3.化学破碎法;4酶学破碎法;■细胞打破之后：;四、初级纯化;;抽提蛋白质过程中所要注意的问题;5.提取缓冲液的体积一般V/G=2～5之间。不宜过大，会使得以后分离、纯化、浓缩的流程时间增长，又增加损失率，

6.抽提的原则是“少量多次”，即对于等量的溶液，分多次抽提比一次抽提好得多

7.要防止蛋白水解酶的作用。可以向溶液中加入二异丙基氟磷酸（DFP）或碘乙酸或苯甲基磺酰氟化物（PMSF）;原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子）有不

同的质量（mass）或密度（density），因此在离

心场中有不同沉降速率。

?不同的蛋白质分子量差别很大，密度差别很小

（不超过15%）。蛋白质的平均密度是1.37g/cm3。

结合蛋白密度差异较大。

?离心力由转子中心到蛋白质界面的距离来决定。;离心（centrifugation）

;低速离心(8000rpm或构对离心力(RCF)1?104g)

高速离心(1?104-2.5?104rpm或RCF=1?104-105g)

差速离心:采用不同的离心速度和离心时间,使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。;Recoverpellet;*;速率区带离心

（rate-zonalcentrifugation）

;;3.过滤分离;五、膜蛋白的释放;■细胞膜蛋白质抽取较困难：;外周蛋白通过次级键和外膜脂质的极性头部螫合在一起，可以用含乙二胺四乙酸（EDTA）的适当缓冲液将其抽提出来。外周蛋白被抽提后，膜一般仍保持完整的双层结构。

固有蛋白嵌合在双层中。抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要仍保持疏水基暴露在外的天然状态，这个过程称为增溶作用;理想的增溶剂（去污剂）既有亲水部分也有疏水部分，当浓度较高时能形成胶团，内部为疏水核，外部为亲水层。

增溶时，膜蛋白疏水部分嵌入胶团的疏水核中而与膜脱离，同时保住了膜蛋白的疏水结构。

被增溶出来的膜蛋白通过透析等方法除掉去污剂，再进一步纯化。;用于增溶过程中的去污剂按结构可分为四种：

阴离子去污剂（脱氧胆酸盐）

阳离子去污剂（溴化十二烷基三甲铵）

两性离子去污剂（二甲基十二烷基甘氨酸）

非离子型去污剂（TritonX－100、辛基葡萄糖苷）。

近年，非离子型去污剂辛基葡萄糖苷应用广泛，因为它的临界胶团浓度高（达25mmol／L），同时易于透析，也有利于膜蛋白的重组。;几种去污剂;?低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）.

?微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。

临界微团浓度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数;?离子型去污剂除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键,使蛋白质变性。

?非离子型去污剂在不同的浓度有不同的作用方式

?浓度较高（CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团.

?浓度较低（CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大

部分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用.;?大部分膜周边蛋白（peripheralprotein）通过离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如Ca2+）结合的试剂进行分离。

;释放膜蛋白还有其它的方法，如：

（l）用磷酸脂酶A消化；

（2）在高pH和高温下进行超声作用；

（3）在低温（－20℃）下，用丙酮抽提，所得干粉可长期贮存。这是一种经典的现在仍在使用的方法;六胞外酶的分离;第三节蛋白质的初步提纯（粗分级）;一、去除