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生物制品分离提取

物理细胞破碎法

主讲人：杨琪

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目录

一、高压匀浆法

高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方法，所用设备是高压匀浆器，由高压主泵和匀浆阀组成。图2-6为高压匀浆器的排出阀结构简图。利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个兆帕，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动进程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。为了控制温度和升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。

二、珠磨法

采用珠磨法进行细胞破碎，被认为是最有效的一种细胞物理破碎法。破碎微生物细胞用的珠磨机有多种形式。珠磨机的主体一般是立式或卧式圆筒型腔体，由电机带动。磨腔内装钢珠或小玻璃珠以提高研磨能力。一般，卧式构型珠磨破碎效率比立式高，其原因是立式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。

二、珠磨法

进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1nm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。

破碎产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走，但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。

三、超声波破碎法

频率超过15-20KHz超声波是人耳难以听到的一种声音，它可使悬浮液中微生物细胞失活，在较高的输入功率下，可破碎微生物细胞。

超声破碎机通常在15-25KHz的频率下操作，可分为槽式和探头直接插入介质两种型式。

一般破碎效果后者比前者好。

四、渗透压冲击法

指细胞经高渗溶液，如一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，使之脱水收缩，然后转入水或缓冲液，因渗透压突然变化，细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。

用此法处理大肠杆菌时，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等释放至溶液中，蛋白质释放量一般仅为菌体蛋白总量的4％-7％。

此法对革兰氏阳性菌不适用。

五、反复冻融法

将细胞放在低温下突然冷冻然后在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性；

另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞溶胀而破裂。

只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，即使反复多次也不能提高收率。

另外，还可能会引起某些蛋白质变性。

六、干燥法

可采用多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。通过干燥使细胞膜渗透性发生变化而破裂，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。抽提进pH值为8-9，此时溶解的蛋白质较多，抽提的温度约为40-50℃，对不稳定的产物需用低温处理。

气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃下的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其他溶剂抽提。气流干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥易抽提。

真空干燥多用于细菌，把干燥成块的菌体磨碎再进行抽提。

冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。

干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活性物质变性。提取不稳定生化物质时，常加某些试剂进行保护，如半胱氨酸、巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂。

七、X-press法

将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的细胞破碎。

主要用于实验室，具有适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。

不适应于对冷冻敏感的物质。

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