第六章核酸的研究技术.pptVIP

第六章核酸的研究技术演示文稿;（优选）第六章核酸的研究技术;现在是3页\一共有102页\编辑于星期五;解链温度（融解温度，Tm）

(meltingtemperature)：;现在是5页\一共有102页\编辑于星期五;增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。;DNA的复性（renaturation)：;现在是8页\一共有102页\编辑于星期五;减色效应：

变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。;1.常用的变性方法：;2.影响复性的因素;核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。;现在是13页\一共有102页\编辑于星期五;现在是14页\一共有102页\编辑于星期五;二、影响杂交的因素;4.杂交液中的甲酰胺

甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，

含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。

使用甲酰胺的优点：;注意：;5.核酸分子的复杂性直接影响复性几率。;三、核酸探针;1.基因组DNA探针;2.cDNA探针（complementaryDNA）;3.RNA探针：检测DNA和mRNA;4.寡核苷酸探针;（三）探针设计原则：;（四）探针标记物的选择;常用的放射性标记物;2.特性：

①检测特异性强；;3.探针标记的方法;现在是29页\一共有102页\编辑于星期五;②随机引物法（randompriming）

人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。;现在是31页\一共有102页\编辑于星期五;③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端;④Klenow片段快速标记DNA探针末端;常用的非放射性标记;1.生物素标记核酸探针

Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。;现在是36页\一共有102页\编辑于星期五;现在是37页\一共有102页\编辑于星期五;现在是38页\一共有102页\编辑于星期五;现在是39页\一共有102页\编辑于星期五;现在是40页\一共有102页\编辑于星期五;四、核酸分子杂交技术;（二）固体支持物种类;（三）常用固相杂交类型;1.Southern印迹杂交;纯化的待测DNA样品;现在是46页\一共有102页\编辑于星期五;southern印迹;2.Northern印迹杂交

是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblotting。;4.原位杂交（insituhybridization）

直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。

应用：1）观察基因在组织中的表达

2）确定基因在染色体中的定位;5.菌落原位杂交（colonysituhybridization）;（四）核酸杂交的应用

在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。

1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验

2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定

3、癌基因点突变分析

4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定

;附：蛋白免疫杂交;（二）所用抗体

1、一抗：针对待测分子的抗体

2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素;（三）操作过程;蛋白印迹;杂交（一抗与特定蛋白结合）;第二节核酸的测序技术;一、Sanger双脱氧终止法

(chain-terminatormethod);原理;Sanger双脱氧链终止法;1.双脱氧终止法测序反应体系包括：;2.Sanger法DNA测序的试剂;3.测序反应的种类;Dyeprimerreactions;Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.

;Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencing