实验五禽流感血清学诊断.pptVIP

;实验课内容;禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。

迄今为止，高致病性AIV都是H5和H7血清亚型，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（MP）。

病禽和带毒禽是主要传染源。鸭、鹅等和野生水禽在本病传播中起重要作用，候鸟也可能起一定作用。感染途径为呼吸道和消化道。本病虽无明显季节性，但常常以冬春季多发。

;?低致病性禽流感（MPAI）

MPAI病毒在野禽中大多数不产生临诊症状。

鸡和火鸡的表现为呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的异常。

?高致病性禽流感（HPAI）

急性败血性，呼吸困难、腹泻、高热、神经症状。

发病率和死亡率很高（50～90%），有的鸡群可达100%。;因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。

?MPAI

病理变化主要在呼吸道，尤其是窦的损害，以卡他、纤维性、脓性或纤维脓性炎症为特征。

?HPAI

在内脏器官和皮肤有各种水肿、出血和坏死，最急性型可能无大体病理变化。;有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。;掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。;96孔“V”形微量反应板,100uL加样器，枪头。

2.生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，禽流感病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），禽流感阳性血清，被检鸡血清。;在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。

死禽采集气管、肺、肝、肾、脾、泄殖腔等组织样品。组织样品先用肉汤培养基或PBS制成10~20（W/V）的悬液，1000r离心10min，取上清液作为试验样品。为防止细菌污染，应加入以下抗生素：青霉素2000μg，链霉素2000g，卡那霉素1000g（每毫升培养液中所含）。样品离心后也可用细菌过滤器过滤除菌。

;病毒分离;常用9～10日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个???胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。

1．照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。

2．在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。

3．用较干的碘酊棉球涂布小孔。;4．用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，缓缓注入0.1～0.2毫升，拔出针头。

5．用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。

6．置37℃温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24小时内死亡的胚弃之）。

7．将死胚收藏于4℃冰箱内，气室向上，6～24小时获尿囊液。;1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。

2.于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。

3.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。;96孔板孔号;4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（#），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。例如表中，该禽流感病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。;1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。

2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50uL生理盐水。

3.第1孔加被检鸡血清50uL，吹吸混合均匀，吸50uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50uL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8……；第12孔加禽流感阳性血清50uL，作为血清对照。;4.自第1孔至12孔各加50uL4个血凝单位的禽流感病毒液，其中第11孔为4单位禽流感病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min。

5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50uL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。;;6.结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（#），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

以100%抑