牛羊猪三种布鲁氏菌三重实时荧光PCR检测方法与分离培养方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA311—2025

牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重

实时荧光PCR检测方法与分离培养方法

Triplereal-timePCRmethodsfordetectingbrucellagenusandisolationprotocolsforbovine,sheepandpigssemen

2025-10-28发布2025-10-28实施

中国兽医协会发布

T/CVMA311—2025

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本标准由中国农业大学动物医学院提出。

本标准由中国兽医协会归口。

本标准起草单位：中国农业大学动物医学院、厦门睿科纳芯科技有限公司、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：何诚、张学迪、崔跃徽、黄宗洋、王慧敏、陈硕、宋娜杰、熊毅、郑敏。

T/CVMA311—2025

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牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重实时荧光PCR检测方法与分离培养方法

1范围

本文件规定了牛羊精液中牛种、羊种和猪种布鲁氏菌三重实时定量PCR检测方法和分离培养方法所包括的试剂和材料、仪器设备、样品采集与处理、操作方法、结果判定和分离培养。

本文件适用于牛羊精液中牛种、羊种和猪种布鲁氏菌的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T18646-2025动物布鲁氏菌病诊断技术

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BHQ：黑洞淬灭基团（BlackHoleQuencher）

BSL-3：生物安全防护三级实验室（BiosafetyLevel3）

Ct：循环阈值（CycleThreshold）

Cy5：花青染料（CyanineDyes）

DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）

HEX：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

RNA：核糖核苷酸（RibonucleicAcid）

ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-Carboxy-X-rhodamine）

T/CVMA311—2025

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5试剂和耗材

5.1试剂

5.1.1除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合GB/T6682中二级水的要求，所有试剂均用无RNA酶的容器分装。

5.1.2提取核酸可使用商品化核酸提取试剂盒。

5.1.3DEPC水：按照附录A中A.1配制。

5.1.40.01mol/LPBS溶液（pH7.4）：按照A.2配制。

5.1.5商品化荧光PCR试剂盒：含荧光PCR反应混合液、DNA聚合酶等。

5.1.6阳性对照：重组质粒，制备过程按附录B。

5.1.7阴性对照：无菌水。

5.1.8内标溶液：用于过程质量控制的重组质粒，制备过程按附录B。

5.2引物和探针

三重荧光PCR扩增用上、下游引物和探针序列按附录C。

6仪器与设备

6.1多通道（四通道）荧光PCR仪。

6.2高速台式冷冻离心机，可控温至4℃,离心力可达12000g以上。

6.3涡旋振荡仪。

6.4微量移液器，量程为0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL和200μL~1000μL。

6.5冰箱，储藏温度在2℃~8℃和?20℃以