猪瘟病毒检测纳米抗体夹心ELISA方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA309—2025

非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心ELISA方法

DetectionofAfricanswinefevervirusbydoublenanobodybasedsandwichELISA

2025-10-28发布2025-10-28实施

中国兽医协会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国农业科学院兰州兽医研究所提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州兽研生物科技有限公司、湖南省动物疫病预防控制中心。

本文件主要起草人：杨吉飞、牛庆丽、兰喜、刘永杰、马维民、李昕、林密、蒋韬、唐小明、赵亚茹、刘志杰、刘光远、关贵全、罗建勋、殷宏。

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非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心ELISA方法

1范围

本文件规定了检测非洲猪瘟病毒的纳米抗体夹心ELISA方法，包括试验原理、试剂、仪器设备及耗材、操作步骤和废弃物处理。

本文件适用于非洲猪瘟病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18648非洲猪瘟诊断技术

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever）

ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）

BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）

ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）

SDAL：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL（NanobodySDALagainstASFVp30protein）

SDAZ：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ（NanobodySDAZagainstASFVp30protein）

5原理

采用双抗体夹心ELISA反应原理，酶标板上包被抗ASFVp30蛋白的纳米抗体SDAL，捕获待检样品中的ASFV抗原，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗ASFVp30蛋白的纳米抗体SDAZ进行孵育。当样品中存在ASFV抗原，形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物，酶标抗体SDAZ上连接的HRP催化显

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色反应；当样品中无ASFV抗原，则不能被纳米抗体SDAL捕获，也不能与酶标抗体SDAZ结合，加入底物后不显色；根据样品检测的吸光度，可以定性判定样品中是否有非洲猪瘟病毒抗原。

6试剂

6.1抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL，制备方法见附录A。

6.2抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ，制备方法见附录B。

6.3HRP标记抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ，制备方法见附录C。

6.4阳性对照，见附录D.1。

6.5阴性对照，见附录D.2。

6.6包被缓冲液，见附录E.1。

6.7封闭液，见附录E.2。

6.8稀释液，见附录E.3。

6.925×浓缩洗涤液，见附录E.4。

6.10TMB底物溶液。

6.11终止液，见附录E.5。

7仪器设备及耗材

7.1分析天平（精确度：0.0001g）。

7.237℃温箱。

7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。

7.4离心机。

7.5单道微量移液器（0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1mL）。

7.6多道移液器（300μL）。

7.71.5mL尖底离心管。

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