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DNA浓度的测定

DNA浓度和纯度的测定

DNA浓度和纯度的测定可以有两种方法：分光光度法溴化乙锭法分光光度法

一、目的

熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。

二、原理

DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，

dsDNA浓度约为50μg/ml

ssDNA浓度约为37μg/ml

RNA浓度约为40μg/ml

寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。

三、材料、试剂及器具

1、材料

提取的PUC19样品、PUC19标准样品

2、试剂

灭菌重蒸水，TE缓冲液

3、器皿

石英比色皿；UV-240紫外分光光度计

四、操作步骤

1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.

2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。

3、设定狭缝后校零。

4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记

录编号和稀释度。

5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。

6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。

7、计算待测样品的浓度与纯度。

DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000

RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000

Ⅱ溴化乙锭法

一、目的

学习用溴化乙锭-标准DNA浓度比较法检测标准DNA的浓度。

二、原理

溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之

间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量

给EB，而EB本身在302nm和366nm处有光吸收。吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色

荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有

关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入

量与样品溶液的DNA含量成正比。

三、材料、试剂及器具

1、标准DNA样品:已知浓度的线型DNA，以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。

2、质粒DNA的酶切样品（待测）

3、溴化乙锭（EB）5μg/ml：以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。

4、紫外透射仪。

四、操作步骤

黑色塑料板（或其他替代物）在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点

取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA浓度分别为（单位：ng/μl）:20、15、

10、5、2、1取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀梯度稀释（单

位：μl）把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察

每一点的荧光强度或拍照。比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度。

五、注意事项

1、标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。

2、待测样品和标准样品使用同样的体积.

3、EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。

4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。

六、实验报告

1、绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度）

2、请估算待测DNA原液的浓度。

要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度；并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想