仪器讲解-紫外分光光度计的使用及注意事项.docxVIP

一、核心原理：为什么它能测量？

紫外分光光度计是基于朗伯-比尔定律?工作的。这是一个核心公式：

A=ε·b·c

其中：

A(Absorbance)：吸光度。仪器直接测得的数值，表示溶液对光的吸收程度。

ε(MolarAbsorptivity)：摩尔吸光系数。是物质的特征常数，代表物质对特定波长光的吸收能力。

b(PathLength)：光程长度。即光穿过样品溶液的距离，通常比色皿的厚度是固定的（如1cm）。

c(Concentration)：浓度。就是我们想要测定的目标物质的浓度。

简单理解：当一束特定波长的紫外/可见光穿过样品溶液时，溶液中的待测物质会吸收一部分光。吸光度（A）与溶液的浓度（c）和光程（b）成正比。因此，通过测量吸光度，我们就可以计算出溶液的浓度。

二、仪器基本结构（您需要操作的部分）

光源：提供连续光谱的钨灯（可见光区）和氘灯（紫外区）。

单色器：将光源发出的复合光分离成单一波长的光。

样品室：放置比色皿的地方。

检测器：检测透过样品的光强度，并将其转换为电信号。

显示/处理系统：显示吸光度、透光率等数据，并进行计算。

三、标准操作步骤（以测量未知样品浓度为例）

下图清晰地展示了紫外分光光度计从开机准备到最终关机的标准操作流程：

定量分析

（测浓度）

定性分析/光谱扫描

（测物质）

开机预热

连接电脑，打开软件

配制溶液

配制空白及系列标准品

设置测量参数

选择波长，设置测量模式

测量类型？

建立标准曲线

测量未知样品

记录并处理数据

扫描样品光谱

分析光谱图

清理与关机

清洗比色皿，关机

下面，我们来详细解读流程中的关键步骤：

准备阶段

开机预热：打开仪器电源和电脑软件，让仪器预热15-30分钟，使光源和电子系统稳定。

配制溶液：

空白溶液(Blank)：通常为溶解样品的溶剂（如超纯水、缓冲液），用于校准仪器的“零点”。

标准品溶液(Standards)：用已知浓度的标准物质配制一系列不同浓度的溶液，用于制作标准曲线。

待测样品溶液(UnknownSamples)：需要测量浓度的未知样品。

测量阶段

设置参数：在软件或仪器面板上设置所需的测量波长。根据实验目的选择模式（如定量测量、光谱扫描等）。

基线校准（校零）：

将一个干净的比色皿装入约3/4的空白溶液。

用擦镜纸将其外壁擦拭干净，透明面对光路方向放入样品室。

关闭样品室盖，按下“AutoZero”或“Blank”键进行校准。此时仪器会认为该空白溶液的吸光度为0（或透光率为100%）。

测量：

定量分析（测浓度）：遵循图表中的左侧路径。

首先，依次测量标准品溶液的吸光度。

然后，软件会自动以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（通常应为一条直线）。

最后，放入待测样品，仪器即可根据其吸光度和标准曲线自动计算出浓度值。

定性分析/光谱扫描（测物质）：遵循图表中的右侧路径。

放入样品，设置波长扫描范围（如200-800nm）。

仪器会绘制出吸光度-波长曲线，通过与标准谱图对比，可以对物质进行初步鉴定或确定其最大吸收波长。

结束阶段

清理与关机：

测量完毕，取出比色皿，及时清洗干净（见下文注意事项）。

在软件中保存数据，关闭软件，然后关闭仪器电源。

填写仪器使用记录。

四、关键注意事项（非常重要！）

关于比色皿

区分材质：

玻璃比色皿：仅用于可见光区（~340nm-1000nm）。

石英比色皿：用于紫外区（~190nm-1000nm）和可见光区。两者切勿混用！

正确持拿：手持比色皿的磨砂面，避免接触透光的两个光滑面，以免留下指纹影响透光。

清洗与润洗：

测量不同样品时，必须用待测溶液润洗比色皿2-3次，以确保浓度准确。

实验结束后，立即用溶剂（或清水）冲洗干净。如果附着有机物，可用弱酸、弱碱或酒精浸泡清洗。

溶液量：注入溶液的量约为比色皿的3/4即可，不要太满，以免溢出污染样品室。

关于样品和操作

溶液要求：待测溶液必须是均匀、透明、无气泡的。如有气泡，可轻弹比色皿壁使其逸出。

浓度范围：为了保证准确性，应使样品的吸光度（A）控制在0.2-0.8之间（最理想范围）。如果吸光度过高（1.5），说明浓度太大，需要适当稀释。

波长选择：定性分析或建立方法时，应使用待测物质的最大吸收波长?进行测量，此时灵敏度最高，抗干扰能力最强。

保持清洁：任何洒出的溶液都要立即擦干净，特别是样品室内。

关于仪器

开关机顺序：严格遵守先开仪器，再开电脑；先关电脑，再关仪器的原则。

防止断电：仪器电源应稳定，避免突然断电，以免损坏光源（特别是氘灯）。

五、常见应用场景

定量分析：测定蛋白质浓度（Bradford法、BCA法）、核酸浓度、药物含量等。

定性分析：通过全波段扫描，对物质进行初步鉴定。

纯度检查：例如，检