第二章第二节基因克隆的载体.pptVIP

染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性第29页，共73页，星期日，2025年，2月5日碱变性法这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

通过加热，尤其是在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。

线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。第30页，共73页，星期日，2025年，2月5日（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的?-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。第31页，共73页，星期日，2025年，2月5日③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。第32页，共73页，星期日，2025年，2月5日用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液第33页，共73页，星期日，2025年，2月5日⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第34页，共73页，星期日，2025年，2月5日蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。第35页，共73页，星期日，2025年，2月5日（3）碱裂解法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA（5-10mg/L）第36页，共73页，星期日，2025年，2月5日溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.4NNaOH，2.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第37页，共73页，星期日，2025年，2月5日最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5?、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。第38页，共73页，星期日，2025年，2月5日这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。第39页，共73页，星期日，2025年，2月5日pBR3224363连接加反应液TetorAmpTet+AmpCK+2.质粒载体相关知识介绍第40页，共73页，星期日，2025年，2月5日质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA开环双螺旋（一个裂口）opencircularDNA,简称ocDNA线状双螺旋（两个裂口）linearDNA,简称L-DNA第4