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琼脂糖凝胶电泳实验操作流程

琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中分离、鉴定和纯化DNA片段的常用技术，其原理基于DNA分子在电场中泳动时，因分子量大小、构象不同而在琼脂糖凝胶中产生迁移率差异，从而实现分离。掌握其规范操作流程，是保证实验结果准确性与可靠性的基础。

一、实验原理简述

在中性pH条件下，DNA分子带负电荷，在电场作用下会向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，如同分子筛，允许小分子物质通过，而大分子物质则受到较大阻力。因此，DNA片段分子量越小，迁移速度越快；分子量越大，迁移速度越慢。通过与已知分子量的DNAMarker对比，可对样品中DNA片段的大小进行初步判断。琼脂糖凝胶的浓度决定了其孔径大小，浓度越高，孔径越小，越适合分离小分子DNA片段；反之，低浓度凝胶则适用于分离较大分子量的DNA片段。

二、实验材料与试剂准备

2.1主要仪器设备

电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、微波炉（或恒温水浴锅）、移液器（及配套吸头）、制胶板、梳子、天平、锥形瓶、量筒等。

2.2主要试剂

琼脂糖、1×TAE（或TBE）电泳缓冲液（Tris-乙酸-EDTA或Tris-硼酸-EDTA缓冲液）、DNA样品、DNAMarker（分子量标准）、核酸染料（如GoldView、EB及其替代物等，注意EB有剧毒，操作需谨慎）、6×（或10×）上样缓冲液（含有溴酚蓝或二甲苯青等指示剂，以及甘油等增加密度的物质）。

三、详细操作步骤

3.1琼脂糖凝胶的制备

1.称量琼脂糖：根据待分离DNA片段的大小和所需凝胶厚度，计算并准确称取适量琼脂糖粉末于锥形瓶中。例如，若需配制1%的琼脂糖凝胶50毫升，则称取0.5克琼脂糖。

2.加入缓冲液：向锥形瓶中加入适量1×TAE（或TBE）电泳缓冲液，轻轻旋转混匀，避免琼脂糖粉末粘壁。缓冲液的用量根据制胶板大小和梳子齿数决定，以能没过梳子齿约1-2毫米为宜。

3.加热溶解：将锥形瓶放入微波炉中，中高火加热至琼脂糖完全溶解。过程中需密切观察，防止溶液暴沸溢出。可中途暂停，小心取出摇晃锥形瓶，使琼脂糖颗粒充分分散并避免局部过热。待溶液变得透明、无颗粒状物质，说明琼脂糖已完全溶解。

4.冷却与加染料：将溶解好的琼脂糖溶液从微波炉中取出，在室温下静置冷却至约50-60℃（手感微烫但可耐受）。此时，加入适量的核酸染料（具体用量参照染料说明书），轻轻颠倒混匀，避免产生气泡。若温度过高加入染料，可能导致染料失效。

5.灌胶：将制胶板两端用挡板封好（若制胶板自带边缘则无需），将梳子垂直插入制胶板的梳齿槽中，确保梳子底部与制胶板之间有一定距离，以形成加样孔。然后将冷却至适当温度的琼脂糖溶液缓慢倒入制胶板中央，避免产生气泡。若不慎产生气泡，可轻轻晃动制胶板或用移液器吸头小心将气泡推至凝胶边缘排除。

6.凝胶凝固：室温下静置约30-60分钟，待琼脂糖凝胶完全凝固。凝固后的凝胶呈乳白色半透明状，具有一定弹性。

7.拔出梳子：小心垂直向上拔出梳子，避免将加样孔撕裂。此时可见清晰的加样凹槽。

8.放入电泳槽：将制胶板连同凝固的凝胶一起放入水平电泳槽中，确保凝胶浸没在1×TAE（或TBE）电泳缓冲液中，液面以高出凝胶表面1-2毫米为宜。若缓冲液不足，需添加至合适高度。

3.2样品的准备与上样

1.样品与上样缓冲液混合：在洁净的离心管中，按照比例将DNA样品与6×（或10×）上样缓冲液混合均匀。通常取1-5微升DNA样品，加入适量上样缓冲液，使上样缓冲液终浓度为1×。同时，准备DNAMarker，同样按比例加入上样缓冲液。

2.上样操作：使用合适量程的移液器，吸取适量混合好的样品（包括DNAMarker）。将移液器吸头垂直对准凝胶的加样孔，缓慢、平稳地将样品注入孔内。注意避免吸头刺破凝胶孔壁，也不要将样品溢出到相邻孔中。上样时，移液器吸头可轻轻接触加样孔边缘的缓冲液，但不要插入凝胶中。每加完一个样品，更换新的吸头，以防止交叉污染。

3.3电泳运行

1.连接电源：确认电泳槽的正负极，DNA样品应靠近负极一侧。将电泳槽的电极线与电泳仪的正负极对应连接好（红色接正极，黑色接负极）。

2.设置参数并启动电泳：打开电泳仪电源，设置合适的电压或电流。通常采用恒压模式，电压设置在____伏之间。电压过高，电泳速度快，但可能导致条带弥散；电压过低，电泳时间长。启动电泳仪，开始电泳。此时可见溴酚蓝指示剂向正极方向移动。

3.电泳过程观察：电泳过程中，注意观察指示剂的迁移位置，估算电泳时间。一般当指示剂迁移至凝胶长度的2/3至3/4处时，即可停止电泳。

3.4凝胶染色与成像

1.停止电泳与取出凝胶：当指示剂迁移至合适位置后，关闭电泳仪电源，断开电极连接。小心取出凝胶（若使用的是预制