第六章蛋白质的分离纯化.pptVIP

聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致使蛋白质沉淀。

原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。

蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度依赖于聚乙二醇的分子量。第61页，共109页，星期日，2025年，2月5日4．温度对蛋白质溶解度的影响。0-40摄氏度大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大

40-50摄氏度大部分蛋白质变得不稳定,开始变性

大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进行.第62页，共109页，星期日，2025年，2月5日糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备第63页，共109页，星期日，2025年，2月5日(三)根据电荷不同的分离方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。

1．电泳在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis)。第64页，共109页，星期日，2025年，2月5日或从方法学的角度给电泳下定义，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。第65页，共109页，星期日，2025年，2月5日带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：

F(电场力)=qE(=qU/s)

Ff(摩擦力)=fv

第66页，共109页，星期日，2025年，2月5日这里，q＝颗粒所带的电量

E＝电场强度或电势梯度＝U/q

U＝两电极间的电势差(以伏特表示)

S=两电板之间距离(以厘米表示)

f＝摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)

v＝颗粒泳动速度(以厘米／秒表示第67页，共109页，星期日，2025年，2月5日当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，

v/E=q/f

在一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因而v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：

u=v/E第68页，共109页，星期日，2025年，2月5日u值可以通过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4--1.0*10-4厘米2·伏特-1·秒-1。蛋白质的泳动度以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。第69页，共109页，星期日，2025年，2月5日电泳基础：自由电泳（移动界面电泳）a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面

b.加电场

c.由于界面处存在浓度梯度，因而产生折射率梯度。利用光学系统可以观察到界面的移动。每个移动界面相当于一个特定蛋白质。第70页，共109页，星期日，2025年，2月5日区带电泳是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。

按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：

1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳,薄膜电泳)

2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉

3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝

4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶第71页，共109页，星期日，2025年，2月5日第72页，共109页，星期日，2025年，2月5日第73页，共109页，星期日，2025年，2月5日盘状电泳在区带电泳基础上发展起来的。

支持物－－聚丙烯酰胺凝胶第74页，共109页，星期日，2025年，2月5日三种物理效应：1。样品的浓缩效应

2。凝胶对分子的筛选效应

3。电泳分离的电荷效应样品分离效果好、分辨率等。第75页，共109页，星期日，2025年，2月5日等电聚焦（电聚焦）蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的介质中进行的。

用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液

介质固体化、操作方便、分离快

蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带。第76页，共109页，星期日，2025年，2月5日双向电泳--AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上,旋转90℃进行第二次电泳,称双向电泳.

优点:设备简单.操作方便,样品用量少第77页，共109页，星期日，2025年，2月5日（三）初步分离1