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遗传学实验操作详细指导手册

前言

遗传学实验是探索生命遗传奥秘、验证遗传理论、培养科学探究能力的重要实践环节。本手册旨在为遗传学实验操作者提供一套系统、规范、详尽的操作指导。无论是初涉遗传学领域的学生，还是需要进行常规实验操作的研究人员，均可参考本手册。手册内容力求严谨求实，注重操作细节与原理阐释的结合，以期帮助操作者顺利完成实验并获得可靠结果。实验操作前，请务必仔细阅读相关章节，理解实验原理，熟悉操作步骤及安全注意事项。遗传学实验往往涉及生物样本、化学试剂及精密仪器，严谨的态度、规范的操作和高度的责任心是确保实验成功与实验安全的首要前提。

第一章：分子遗传学基本操作技术

实验一：植物基因组DNA的提取与纯化

1.1实验目的

掌握植物基因组DNA提取的基本原理和常用方法，学会使用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取植物叶片总DNA，并对提取的DNA进行质量初步检测。

1.2实验原理

植物细胞具有细胞壁、细胞膜、细胞核等结构。CTAB是一种阳离子去污剂，在高离子强度下（通常使用氯化钠）能够溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在有机溶剂（如氯仿-异戊醇）中不溶，通过离心可将其与蛋白质、多糖等杂质分离。随后，利用无水乙醇或异丙醇可以将DNA从CTAB溶液中沉淀出来。RNaseA的加入可去除样品中的RNA，从而得到较纯净的基因组DNA。

1.3主要实验材料与试剂

*实验材料：新鲜的植物叶片（如拟南芥、水稻或烟草叶片）。

*主要试剂：

*CTAB提取缓冲液：含CTAB、氯化钠、Tris-HCl(pH8.0)、EDTA(pH8.0)。使用前需加入适量β-巯基乙醇。

*氯仿-异戊醇混合液（体积比24:1）。

*无水乙醇。

*70%乙醇。

*TE缓冲液(pH8.0)或ddH?O。

*RNaseA溶液(10mg/mL，已去除DNase)。

*液氮。

1.4主要实验仪器与耗材

*高速台式离心机、恒温水浴锅、研钵与研杵、移液器（1mL,200μL,20μL,10μL）及配套吸头、离心管（1.5mL,5mL）、烧杯、量筒、玻璃棒、记号笔、冰箱。

1.5实验步骤

1.样品准备与研磨：取适量新鲜植物叶片（约0.1-0.2g），用蒸馏水洗净，吸干表面水分。将叶片剪成小块，放入预冷的研钵中，加入少量液氮，迅速研磨至粉末状。在研磨过程中，需不断添加液氮以保持材料冷冻状态，避免DNA降解。

2.CTAB裂解：将研磨好的粉末迅速转移至已预热（65℃）的CTAB提取缓冲液（约____μL）的1.5mL离心管中，立即用玻璃棒或移液器吹打混匀。将离心管置于65℃恒温水浴锅中保温30-60分钟，期间每隔10-15分钟轻轻颠倒混匀一次。

3.去蛋白：取出离心管，冷却至室温。加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，轻轻颠倒离心管10-15分钟，使两相充分混合，形成乳浊液。

4.离心分离：将离心管放入高速台式离心机中，____rpm离心10-15分钟。离心后，溶液分为三层：上层为含DNA的水相，中层为变性蛋白层，下层为有机相。

5.转移上清：用移液器小心吸取上层水相（注意不要吸到中间蛋白层和下层有机相），转移至新的1.5mL离心管中。

6.DNA沉淀：向上清液中加入0.6-1倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，直至出现絮状DNA沉淀。可置于-20℃冰箱中静置30分钟或更长时间，以促进DNA充分沉淀。

7.离心收集DNA：____rpm离心5-10分钟，弃上清。可见管底有白色或淡黄色的DNA沉淀。

8.洗涤沉淀：加入1mL预冷的70%乙醇，轻轻颠倒离心管，洗涤DNA沉淀。____rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤一次。

9.干燥与溶解：将离心管倒置在干净的滤纸上，室温晾干或真空干燥DNA沉淀（注意不要过度干燥，否则DNA难以溶解）。待乙醇完全挥发后，加入____μLTE缓冲液或ddH?O，放入4℃冰箱中溶解过夜，或55℃水浴中温育30分钟以加速溶解。

10.RNase处理：向溶解的DNA溶液中加入适量RNaseA溶液（终浓度为20-50μg/mL），轻轻混匀，37℃水浴保温30-60分钟，以去除RNA。

11.DNA保存：处理后的DNA溶液可置于-20℃冰箱中长期保存备用。

1.6结果观察与记录

1.肉眼观察：观察DNA沉淀的颜色、形态和量。高质量的DNA沉淀通常为白色絮状。

2.紫外分光光度法检测（选做）：取少量DNA溶液，用TE缓冲液或ddH?O适当稀释后，使用紫外分光光度计测定其在260nm、280nm和230nm处的吸光度值。计算A260/A280比值（理想值为1.8左右）和A260/A230比值（理想值大于2.0），评估