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乳源抗菌-免疫调节融合肽原核表达及其抗菌活性初步研究

一、引言

（一）研究背景与意义

在生物医药领域，寻找高效、安全且不易产生耐药性的抗菌物质一直是研究的重点。传统抗生素的广泛使用甚至滥用，导致细菌耐药性问题日益严峻，给临床治疗带来了巨大挑战。据统计，每年因耐药菌感染导致的死亡人数不断攀升，因此，开发新型抗菌药物迫在眉睫。

乳源抗菌肽作为一类天然的抗菌物质，展现出了独特的优势。其中，乳铁蛋白抗菌肽LfcinB便是典型代表。LfcinB来源于牛乳铁蛋白N端的25个氨基酸残基，相对分子质量约为3100。它具有广谱抗菌活性，对众多食品病原细菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等都有显著的杀灭效果，其抗菌活性比牛乳铁蛋白强400倍。然而，在一定浓度盐离子条件下，LfcinB的抗菌效果会大幅降低，这在一定程度上限制了其应用。

与此同时，乳源免疫调节肽也逐渐走进人们的视野。从牛酪蛋白酶解产物中分离出的六肽PGPIPN，位于β-酪蛋白的63-68残基上，是一种典型的乳源免疫调节肽。研究发现，PGPIPN能促进机体的免疫反应，增强免疫细胞的活性，还具有抗氧化、延缓机体衰老和抗疲劳等多种功能，在调节机体免疫平衡方面发挥着重要作用。

天然的乳源抗菌肽和免疫调节肽虽然具有诸多优异性能，但它们在提取和纯化过程中面临着重重困难。不仅步骤繁琐、成本高昂，而且产量极低，难以满足大规模生产和应用的需求。而通过基因工程的方法，构建抗菌-免疫调节融合肽，将两种肽的优势结合起来，使其既具备抗菌活性，又拥有免疫调节功能，为新型抗菌药物的研发开辟了一条崭新的道路。这种融合肽有望克服传统抗生素的弊端，为解决细菌耐药性问题提供新的策略，在医药、食品保鲜等领域展现出广阔的应用前景。

（二）研究目标

本研究旨在构建乳源抗菌-免疫调节融合肽的原核表达体系。通过精心设计和筛选，运用先进的基因工程技术，将编码乳源抗菌肽和免疫调节肽的基因进行拼接，并插入到合适的原核表达载体中，转化至大肠杆菌等原核宿主细胞，实现融合肽的高效表达。

在成功表达融合肽后，利用一系列分离纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，对融合肽进行纯化，获得高纯度的目标产物。最后，采用科学合理的实验方法，如细菌生长曲线测定、抑菌圈实验等，初步探究融合肽对常见病原菌的抗菌活性，为后续深入研究其抗菌机制以及开发新型抗菌药物奠定坚实的基础。

二、材料与方法

（一）融合肽设计与基因合成

1.肽段序列设计

本研究以牛乳铁蛋白抗菌肽（LfcinB）和乳源免疫调节肽（PGPIPN）为基础，开展融合肽的设计工作。LfcinB的氨基酸序列为APRKNVRWCSTITQCEWFKCRRWQWRMK，PGPIPN的氨基酸序列则是PGPIPN。为了将这两种具有独特功能的肽段连接起来，构建出兼具抗菌和免疫调节活性的融合肽，我们选用了柔性连接臂（GGGGS）。这种连接臂具有良好的柔韧性，能够减少连接后对两个肽段空间结构和生物活性的影响，使融合肽能更好地发挥其功能。将LfcinB、连接臂和PGPIPN依次连接，构建出的融合肽命名为AIFP，其完整氨基酸序列为APRKNVRWCSTITQCEWFKCRRWQWRMK-GGGGS-PGPIPN。

考虑到原核表达系统中大肠杆菌的密码子偏好性，为了提高融合肽在大肠杆菌中的表达水平，我们借助专业的生物学软件，对融合肽AIFP的基因序列进行了全面分析和优化。通过替换部分密码子，使其更符合大肠杆菌的翻译机制，从而确保后续在大肠杆菌中的高效表达，为融合肽的大量制备奠定基础。

2.基因合成与载体构建

在完成融合肽AIFP的基因序列优化后，采用重叠延伸PCR技术来合成融合肽基因。重叠延伸PCR技术是一种高效的基因合成方法，它能够通过引物的设计和多次PCR反应，将不同的DNA片段精确地拼接在一起，从而获得我们所需的完整基因序列。

为了便于后续将融合肽基因克隆到原核表达载体中，在合成基因的两端引入了限制性内切酶位点，分别是BamHI和XhoI。这两种限制性内切酶具有特异性的识别序列，能够在特定位置切割DNA，为基因克隆提供了便利。在PCR反应体系中，加入经过精心设计的引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等试剂，通过精确控制反应温度和循环次数，经过多轮变性、退火和延伸反应，成功合成了融合肽AIFP的基因。

将合成的融合肽基因与原核表达载体pGEX-KG进行连接，构建重组质粒pGEX-KG-AIFP。在连接过程中，使用T4DNA连接酶将经过BamHI和XhoI双酶切的融合肽基因与同样经过双酶切的pGEX-KG载体进行连接，使融合肽基因准确地插入到载体的多克隆位点中。连接产