核酸分子杂交及芯片技术演示文稿.pptVIP

核酸分子杂交及芯片技术演示文稿;核酸分子杂交及芯片技术;1、变性（denaturation）

在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。无共价键断裂。;2、融解温度（Tm值）：

在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。;影响Tm的因素：

（1）DNA碱基的组成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低;（2）溶液的离子强度

低离子强度Tm值越低

高离子强度Tm值越高;3、复性

变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋的过程。;;可逆性(非共价结合)

序列特异性(碱基互补配对);4、杂交

;;教学内容;一、概念

探针（probe）

指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。

例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。

;核酸探针

指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。;二、分类

根据性质和来源不同：

（1）基因组DNA探针

有内含子，杂交效率低

（2）cDNA探针

无内含子，适用于基因表达的检测

（3）RNA探针

单链性，特异性高；不稳定，易降解

（4）寡核苷酸探针

合成方便，灵敏度受长度限制稍差;二、分类

根据标记方法不同：

（1）放射性探针

（2）非放射性探针

;理想的核酸探针标记物应具备

①高度的敏感性

②标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质；③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性率低外，尚需考虑环境污染少，价格低；

④若用酶标记，应对酶的Km值影响不大，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。;（一）标记物

放射性同位素标记物

非放射同位素标记物

;1.放射性

常用的有32P/35S/3H。

特点：

检测的灵敏度和特异性高

射线对人体有伤害

放射性物质需特殊的处理

半衰??短不宜存放使用;2.非放射性标记物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素、酶。

特点：

敏感性不如同位素标记

稳定性高、检测时间短

操作简便

不需特殊的防护设备

不存在放射性污染;（二）标记法

;1、随机引物法（randompriming）

利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。

将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。;随机引物（6-8nt）：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=409648=65536;2、切口平移法

◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH末端。

◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。

◆4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。

生成的两条链都被同位素均匀标记。;大肠杆菌DNA聚合酶I的活性种类？;大肠杆菌DNA聚合酶I

（1）5’3’聚合酶活性;（2）3’5’外切酶活性;（3）5’3’外切酶活性;

;3.末端标记法

末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。

?5’端标记法

3’端标记法;（1）5’端标记法（T4多聚核苷酸激酶）

用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，经T4多聚核苷酸激酶催化，将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。;;（2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段）

大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。

;第三十四页，共六十七页。;教学内容;核酸分子杂交