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实验动物学细胞培养操作方法

一、实验动物学细胞培养概述

细胞培养是实验动物学中的一项基础技术，广泛应用于生物学、医学、药理学等领域的研究。通过体外培养动物细胞，研究人员可以研究细胞的生长、增殖、分化、衰老等过程，以及细胞与外界环境的相互作用。细胞培养操作方法涉及多个环节，包括细胞准备、培养基配制、细胞接种、培养条件控制、细胞观察与分析等。

（一）细胞培养的基本原则

1.无菌操作：细胞培养过程中必须保持无菌环境，防止微生物污染。

2.温度控制：细胞培养通常在37℃恒温条件下进行，以模拟体内环境。

3.pH调节：培养基的pH值应维持在7.2-7.4之间，以利于细胞生长。

4.气体环境：细胞培养需要95%空气和5%二氧化碳的混合气体环境。

二、细胞培养操作步骤

（一）细胞准备

1.细胞来源：可以选择实验动物的组织、器官或细胞系作为细胞来源。

2.细胞分离：通过酶解法（如胰蛋白酶消化）或机械法（如组织研磨）分离细胞。

3.细胞计数：使用血球计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，确定细胞密度。

（二）培养基配制

1.基础培养基：常用的基础培养基有DMEM、F12、RPMI-1640等。

2.加血清：通常添加10%-20%的胎牛血清（FBS）提供生长因子和营养物质。

3.添加其他成分：根据实验需求，可添加双抗（青霉素-链霉素）、L-谷氨酰胺等。

（三）细胞接种

1.培养皿选择：根据实验需求选择合适的培养皿（如60mm、100mm）。

2.细胞稀释：将细胞悬液进行适当稀释，确保接种密度在1×10^4-1×10^6cells/cm2。

3.接种操作：将细胞悬液加入培养皿，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。

（四）培养条件控制

1.温度：将培养皿置于37℃恒温培养箱中。

2.气体：保持95%空气和5%二氧化碳的混合气体环境。

3.湿度：培养箱内湿度应维持在90%以上。

（五）细胞观察与分析

1.生长观察：每天在倒置显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞形态和贴壁情况。

2.收敛时间：记录细胞从接种到完全贴壁所需时间，通常为24-48小时。

3.扩增倍数：计算细胞增殖倍数，评估细胞生长情况。

三、注意事项

（一）无菌操作

1.操作前洗手消毒，穿戴无菌手套。

2.使用无菌吸管、培养皿等实验器材。

3.操作环境应保持洁净，避免空气流动。

（二）培养基更换

1.定期更换培养基，通常每2-3天更换一次。

2.更换前应观察培养基颜色和细胞状态，避免过度污染。

（三）细胞冻存与复苏

1.细胞冻存：将细胞悬液加入冻存液（含DMSO），置于-80℃冻存。

2.细胞复苏：将冻存管快速置于37℃水浴，然后加入完全培养基。

四、细胞传代操作

细胞传代是为了维持细胞活力，防止细胞过度增殖导致衰老或死亡。传代操作需要在细胞达到一定密度时进行，通常在80%-90%confluent（汇合度）时进行。

（一）准备阶段

1.材料准备：准备胰蛋白酶（0.25%）、EDTA（0.02%）、完全培养基、无菌吸管、培养皿/瓶、离心管等。

2.环境准备：确保超净工作台洁净，紫外灯照射消毒30分钟，开启通风。

3.细胞观察：在倒置显微镜下观察细胞状态，确认生长良好，无污染迹象。

（二）解贴操作

1.加入消化液：使用无菌吸管吸取消毒后的胰蛋白酶-EDTA混合液，缓慢加入培养皿/瓶中，量约为培养基体积的1/10。

2.消化控制：将培养皿/瓶置于37℃培养箱中消化，消化时间通常为3-10分钟，具体时间根据细胞类型调整。可轻敲培养皿辅助消化。

3.判断标准：观察细胞边缘出现收缩，细胞变圆即可停止消化。避免过度消化导致细胞损伤。

（三）细胞收集

1.加入培养基：向培养皿/瓶中加入适量完全培养基，轻柔吹打悬浮细胞。

2.吸出细胞：使用无菌吸管将细胞悬液吸出，转移至无菌离心管中。

3.离心收集：将离心管置于离心机中，以1000-1500rpm离心5-10分钟。

（四）细胞重悬

1.弃上清：小心弃去上清液，注意保留细胞沉淀。

2.加入培养基：向离心管中加入新鲜完全培养基，重悬细胞。

3.计数稀释：取部分细胞悬液进行计数，根据所需接种密度进行稀释。

（五）接种新培养皿

1.分装细胞：将稀释后的细胞悬液分装至新的培养皿/瓶中。

2.接种操作：轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，避免剧烈震荡。

3.记录信息：记录传代日期、细胞类型、接种密度等信息。

五、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

1.细胞计数：确认细胞密度，通常在1×10^6-5×10^6cells/mL。

2.加入冻存液：向细胞悬液中加入冻存液（通常含10%DMSO和90%基础培养基），缓慢混匀。

3.分装冻存管：将细胞悬液分装至无菌冻存管中，每管1-2mL。

4.预冷处