基于RAPD标记的杜仲优良品种（无性系）DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析.docxVIP

基于RAPD标记的杜仲优良品种（无性系）DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

一、研究背景与意义

（一）杜仲资源保护与品种鉴定的研究现状

杜仲（EucommiaulmoidesOliver），作为杜仲科杜仲属的落叶乔木，是我国特有的第三纪孑遗植物，在植物分类学中占据着独特地位，为单科单属单种，具有极高的科研价值。它不仅是名贵的中药材，树皮、树叶皆可入药，有着补肝肾、强筋骨、降血压等功效，在《神农本草经》中就被列为上品；同时也是重要的工业原料，其皮、叶、果实中均含有杜仲胶，是天然橡胶的优质来源。

随着现代医学研究的深入，杜仲在调节血脂、抗疲劳、抗骨质疏松等方面的显著效果也被逐步揭示，其应用范围不断拓展，市场需求日益增长。但长期以来，杜仲传统的繁殖方式主要为种子繁殖，这种方式易受环境因素影响，导致品种混杂，遗传多样性降低。并且，由于杜仲皮在药用等方面的重要价值，过度采伐现象严重，使得野生杜仲资源急剧减少，目前已被列为国家二级保护野生植物。

在品种鉴定方面，早期主要依赖形态学标记，即通过观察杜仲的外部形态特征，如树皮颜色、叶片形状、果实大小等进行品种区分。但这些特征极易受到生长环境的影响，稳定性和准确性欠佳。例如，生长在不同土壤肥力和水分条件下的同一品种杜仲，其叶片大小和颜色可能会出现明显差异，从而给准确鉴定带来困难。后来，生理生化标记，如同工酶标记也曾被应用于杜仲品种鉴定。同工酶是基因的表达产物，具有一定的特异性，但它同样易受外界环境因素和自身激素变化的影响，限制了其在品种鉴定中的广泛应用。

（二）DNA指纹图谱在林木遗传研究中的应用价值

DNA指纹图谱技术是一种基于DNA多态性的分子标记技术，它能够直接反映生物个体或种群间DNA水平上的差异，具有多位点性、高变异性和稳定遗传性等特点。自20世纪80年代诞生以来，已在人类遗传学、动植物育种、法医鉴定等众多领域得到广泛应用。

在林木遗传研究领域，DNA指纹图谱技术展现出了巨大的优势和应用价值。首先，它能够准确地鉴定林木品种，解决了传统鉴定方法受环境影响大的问题。以杨树为例，利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术构建DNA指纹图谱，成功区分了多个形态相似的杨树品种，为杨树的良种选育和推广提供了可靠依据。其次，该技术可以深入分析林木的遗传多样性，了解不同种群或个体间的遗传关系，这对于珍稀林木资源的保护和利用至关重要。通过对银杏种群的DNA指纹图谱分析，揭示了其遗传多样性水平及地理分布格局，为银杏资源的保护策略制定提供了科学指导。此外，在林木谱系追踪方面，DNA指纹图谱技术也发挥着重要作用，能够准确追溯林木的亲缘关系，为林木杂交育种的亲本选择提供有力支持。

对于杜仲而言，由于其无性系繁殖的特性，不同无性系之间的遗传差异较小，传统方法难以精确鉴别。而利用RAPD等分子标记构建DNA指纹图谱，可以敏锐地捕捉到这些细微的遗传差异，为杜仲优良品种及无性系的精准鉴定提供了有效手段，对于杜仲种质资源的保护、良种审定以及知识产权保护都具有深远意义，能够有力推动杜仲产业的可持续发展。

二、材料与方法

（一）实验材料的选择与预处理

本研究精心选取了14个具有代表性的杜仲优良品种及无性系，这些材料来源广泛，涵盖了不同的地理区域和育种目标。其中，“华仲1号”是通过长期的人工选育，在河南地区培育出的优良品种，具有生长迅速、树皮厚实等特点，在药用和工业原料方面都表现出色；“华仲30号”则侧重于药用成分的积累，其有效成分含量高于普通品种，在医药领域具有较高的应用价值；“晋X003”是山西地区选育的无性系，对当地的干旱、寒冷等特殊环境具有较强的适应性，展现出良好的抗逆性能。这些品种及无性系的选择，为全面、深入地研究杜仲的遗传多样性和构建精准的DNA指纹图谱提供了丰富的素材。

在样本制备过程中，采集的新鲜叶片均来自于生长健壮、无病虫害的杜仲植株。为保证实验结果的准确性和可靠性，采集时间统一选择在植株生长旺盛的夏季，此时叶片的生理活性最强，所含的遗传物质也最为稳定。采集后的叶片立即用蒸馏水冲洗干净，去除表面的灰尘和杂质，然后用滤纸吸干水分，迅速放入液氮中冷冻保存，以防止DNA降解。

基因组DNA的提取采用改良CTAB法，该方法在传统CTAB法的基础上进行了优化，能够更有效地去除多糖、多酚等杂质，提高DNA的纯度和质量。具体操作如下：将冷冻的叶片在液氮中研磨成粉末状，迅速转移至含有预热CTAB提取缓冲液的离心管中，充分混匀后，置于65℃水浴锅中保温1-2小时，期间每隔15分钟轻轻振荡一次，使细胞充分裂解，DNA充分释放。随后，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液，剧烈振荡10分钟，使蛋白质等杂质充分沉