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实验动物学样本处理方案

###一、实验动物学样本处理方案概述

实验动物学样本处理是科研实验中的关键环节，涉及样本采集、保存、处理和分析等多个步骤。规范的样本处理方案不仅能保证实验结果的准确性，还能提高样本利用效率，降低实验误差。本方案旨在提供一套系统化、标准化的样本处理流程，确保各环节操作符合科学要求。

###二、样本采集

####（一）采样原则

1.**无菌操作**：所有采样过程需在无菌环境中进行，避免外源污染。

2.**标准化流程**：严格遵循实验设计要求，确保样本采集的一致性。

3.**个体标识**：每个样本需附上唯一标识码，记录采集时间、动物编号等信息。

####（二）常见采样方法

1.**血液样本**

-**采集方式**：股动脉或心脏采血，常用注射器或真空采血管。

-**体积控制**：成年实验动物每次采血量不超过体重的5%，幼年动物不超过3%。

-**抗凝处理**：根据检测需求选择抗凝剂（如EDTA、肝素等）。

2.**组织样本**

-**取材部位**：根据实验目的选择特定器官（如肝脏、肾脏等）。

-**固定方法**：立即置入4%多聚甲醛溶液中固定，时间控制在24-48小时。

-**冷冻样本**：需快速投入-80℃冻存，避免细胞结构破坏。

3.**尿液样本**

-**收集方式**：代谢笼收集24小时尿液，或导尿管采集即时样本。

-**保存条件**：4℃保存，若需长期保存可添加防腐剂（如甲苯）。

###三、样本保存与运输

####（一）保存条件

1.**血液样本**：4℃保存不超过4小时，需尽快离心分离血浆。

2.**组织样本**：固定后置于-20℃或-80℃保存，长期存储建议-80℃。

3.**细胞样本**：接种后需在37℃、5%CO?环境下培养，及时处理。

####（二）运输要求

1.**冷链运输**：需冷藏的样本使用保温箱，配备冰袋或冰排。

2.**记录完整**：运输途中需记录温度变化，确保样本状态可控。

3.**安全包装**：尖锐样本（如针头）需用专用容器封装，避免刺伤。

###四、样本处理与分析

####（一）血液样本处理

1.**离心分离**：3000rpm离心10分钟，分离血浆与血细胞。

2.**生化检测**：使用全自动生化分析仪检测肝肾功能、血糖等指标。

3.**免疫学检测**：ELISA法检测炎症因子、抗体等，需设空白对照。

####（二）组织样本处理

1.**石蜡包埋**：组织块脱水后浸入石蜡，用于病理切片。

2.**免疫组化（IHC）**：采用SABC法或EnVision法检测蛋白表达。

3.**基因表达分析**：RNA提取后反转录为cDNA，进行qPCR检测。

####（三）数据记录与归档

1.**原始数据整理**：实验结果需标注样本编号、检测时间等信息。

2.**电子存档**：将数据导入Excel或数据库，建立索引便于查询。

3.**废弃物处理**：按实验室规定销毁或回收样本残渣，避免交叉污染。

###五、注意事项

1.**避免溶血**：采血时轻柔操作，减少组织损伤。

2.**及时处理**：高活性样本（如酶类）需尽快检测，防止降解。

3.**定期校准**：检测仪器需每月校准，确保结果可靠性。

###四、样本处理与分析（续）

####（二）组织样本处理（续）

1.**石蜡包埋（续）**

-**脱水步骤**：组织块先置于70%乙醇中浸泡24小时，再依次使用80%、90%、95%、100%乙醇各脱水30分钟。

-**透明处理**：将脱水后的组织块浸泡于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各30分钟，使其完全透明。

-**浸蜡与包埋**：缓慢加入融化的石蜡（56-58℃），浸泡2小时后置于包埋框中冷却定型。

2.**免疫组化（IHC）（续）**

-**抗原修复**：切片脱蜡至水，使用EDTA或柠檬酸盐缓冲液在95℃加热修复20分钟。

-**封闭操作**：滴加5%牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉封闭1小时，阻断非特异性结合。

-**孵育流程**：

(1)孵育一抗（稀释浓度0.1-1μg/mL），4℃过夜，次日复温至37℃。

(2)洗涤：TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟。

(3)孵育二抗（生物素化或辣根过氧化物酶标记），37℃避光1小时。

(4)显色：DAB显色剂显色5-15分钟，显微镜下观察颜色变化。

3.**基因表达分析（续）**

-**RNA提取（续）**：

(1)组织匀浆：加入TRIzol试剂，用组织研磨器充分研磨。

(2)氯仿抽提：加入氯仿-异戊醇（体积比24:1），颠倒混匀后离心，收集上清液。

(3)异丙醇沉淀：加入异丙醇，-20℃沉淀RNA，离心后弃上清。

(4)洗涤与溶解：用