常用实验基本技术细胞培养.pptVIP

第1页，共25页，星期日，2025年，2月5日四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Westernblot）细胞培养技术局限性联合应用第2页，共25页，星期日，2025年，2月5日细胞培养技术细胞培养（Cellculture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。第3页，共25页，星期日，2025年，2月5日培养细胞的生存条件无菌环境（器皿、超净台）超纯水温度（37℃左右）气体（5%CO2/空气）PH值（7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱）营养条件（基础培养基+10%FBS）渗透压、培养基质等第4页，共25页，星期日，2025年，2月5日细胞培养用液平衡盐溶液：洗涤组织、细胞D-Hanks液、PBS液等。消化液：分散细胞0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用培养液：细胞生存、生长和繁殖基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化10%左右的胎牛血清（FBS）第5页，共25页，星期日，2025年，2月5日培养细胞的来源直接取材：实验动物、胚胎、临床标本等细胞系：各实验室保存细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、中国医科院细胞中心第6页，共25页，星期日，2025年，2月5日培养方式原代培养：直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。只能原代培养：神经元、心肌细胞等。传代培养：当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制，需要分散稀释后重新培养。常见：肿瘤细胞系第7页，共25页，星期日，2025年，2月5日培养细胞的处理改变细胞外部因素改变细胞内部因素第8页，共25页，星期日，2025年，2月5日外部因素药物高温低氧射线…第9页，共25页，星期日，2025年，2月5日内部因素改变细胞内基因表达水平：上调：基因转染下调：RNAi第10页，共25页，星期日，2025年，2月5日细胞转染转染（transfection）是指将外源性DNA或RNA导入细胞的过程。上调目的基因表达：质粒载体病毒载体下调目的基因表达：化学合成siRNA质粒载体病毒载体第11页，共25页，星期日，2025年，2月5日转染方法电转法脂质体介导的转染法病毒载体介导的转染法…第12页，共25页，星期日，2025年，2月5日转染试剂脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。常用：Invitrogen公司Lipofectamine2000可用来转染质粒和siRNA.其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAXTransfectionReagent专门用来转染siRNA.第13页，共25页，星期日，2025年，2月5日瞬时转染与稳定转染瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。第14页，共25页，星期日，2025年，2月5日真核筛选标记第15页，共25页，星期日，2025年，2月5日设立对照组空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。ScrambledsiRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambledsiRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的mRNA没有明显的同源性。第16页，共25页，星期日，2025年，2月5日细胞特性检测活力：MTT实验凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验分化：形态学观察、分化标志物检测致瘤性：体内成瘤实验…第17页，共25页，星期日，2025年，2月5日靶基因表达水平检测RT-P