基因表达沉默技术.pptVIP

ThankYou!*第62页，共62页，星期日，2025年，2月5日教学内容…….*****回顾一下什么叫RNAi?参与RNAi过程的……*****再来回顾一下RNAi的发现历史。1995年，康奈尔大学SuGuo博士，在试图利用反义RNA技术阻断秀丽线虫par-1基因时，发现了实验对照正义RNA也能阻断par-1基因的表达。困惑……*****1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello解释了困惑他们将…….Guo等人与诺贝尔奖擦肩而过，而Fire和Mello抓住困惑不放，也就抓住了成功。*****通过实验阐明了这一反常现象：将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽线虫比单独注射反义RNA诱导基因沉默效率高10倍。由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平(Fire等，1998)。*****再来简单回顾一下RNAi作用机制*****由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗研究领域。在座各位十有八九也要进行siRNA实验设计。怎样进行siRNA设计？设计的siRNA是什么样？看看天然siRNA分子是什么样，就会一目了然。长度悬端*****找到ADAM17基因的描述*****CDS78..2552我们进行siRNA设计的靶序列*****科研工作者的经验总结：学者根据经验建议：寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点，较易取得干扰成功。*****瞬时；长期：构建siRNA针核表达载体-转染细胞-稳定表达克隆谁来启动siRNA表达呢？*****如何进行siRNA基因设计和克隆？举例说明反向互补序列*****工作不工作，要导入细胞内才知道。*****导入细胞后，接下来做什么来验证siRNA？最有说服力的是……*****实际工作中，合成or构建载体？*****siRNA实验设计……*****形成双链抑制翻译………;反义mRNA*****技术自出现以来…..针对癌基因的反义核酸文章…..*****核酸在体内易被降解，研究人员…….*****thefirstgenerationphosphorothioatebackbonemodification磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子。PSDNAON的主要缺点是能与一些蛋白结合，这可以引起细胞毒性。另外一个缺点是与互补RNA的亲和性会稍微降低*****第二代寡聚核苷酸在核糖的2位置含有烷基修饰。2-O-甲基和2-O-乙基是这类修饰的两个重要成员。具有这种修饰的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，并且与互补RNA的亲和性也得到了稍微提高。然而这些有利的性质被2-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA这个缺点所抵消*****感兴趣的同学可上网反义核酸药物上市？*****每年*****1个死亡病例和1个产生严重中枢神经系统副作用的病例，公司决定暂时中止Tysabri的销售*****第二节反义核酸技术*第30页，共62页，星期日，2025年，2月5日1978年，Stephenson和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。1984年，Izantweintraub提出了“反义核酸技术”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA,1978;75:285-288.历史由来*第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和反义RNA。基本概念反义RNA技术反义DNA技术*第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日反义抑制的主要机理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶H降解。反义核酸mRNARNaseH*第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日论著超过１６０００篇。基因功能研究（1994年流行）如抗病毒或抗