第四章单克隆抗体和抗体工程.pptVIP

四、抗体融合蛋白一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变区，如用CD4、白细胞介素3和肿瘤坏死因子等。第60页，共87页，星期日，2025年，2月5日五、抗体酶抗体酶(abzyme)：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。抗体酶的制备(自学)第61页，共87页，星期日，2025年，2月5日筛选：HAT培养基筛选原理DNA内源性途径(D-主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)次嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase,TK)B淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途径(S-旁路途径)第28页，共87页，星期日，2025年，2月5日1、未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合B淋巴细胞：HGPRT+，TK+在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。第29页，共87页，星期日，2025年，2月5日骨髓瘤细胞HGPRT－，TK－在HAT培养液中，因此自身没有“S途径”“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞第30页，共87页，星期日，2025年，2月5日骨髓瘤细胞HGPRT-，TK-既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。3、杂交瘤细胞第31页，共87页，星期日，2025年，2月5日浆细胞自发或诱发突变脾B细胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞(带有X蛋白的抗体)细胞融合转到HAT培养基上非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长第32页，共87页，星期日，2025年，2月5日在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物,大量生产单克隆抗体细胞大量培养罐大量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡第33页，共87页，星期日，2025年，2月5日三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右。筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术。免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。第34页，共87页，星期日，2025年，2月5日1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10?g/ml，4℃，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4℃，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4℃，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选第35页，共87页，星期日，2025年，2月5日杂交瘤细胞培养细胞向培养基中分泌抗体收集培养基预先包埋好目标抗原的培养板抗原与抗体的结合EEEEE加入二抗显色说明有抗体的存在在酶的情况下,与二抗结合的分子产生特殊的颜色(ELISA)第36页，共87页，星期日，2025年，2月5日第37页，共87页，星期日，2025年，2月5日（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。第38页，共87页，星期日，2025年，2月5日有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。第39页，共87页，星期日，2025年，2月5日软琼脂法：在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，