第五章核酸的分子杂交.pptVIP

第61页，共93页，星期日，2025年，2月5日多色FISH图第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日由于FISH具有安全、经济、灵敏快速和精确等优点，它已被广泛运用于：9.基因诊断、产前诊断及肿瘤病理学等领域……1.基因定位2.染色体的同源性、染色体起源与进化的研究3.染色体与基因突变的研究4.异常染色体及染色体病检测5.外源染色体的鉴定6.转基因动植物外源基因整合位点的检测7.比较基因组结构和功能8.DNA分子及基因物理图谱的构建第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日（六）FISH技术应用实例第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日杨征等(2000)：以人的ras基因为探针，运用荧光原位杂交技术，首次对ras基因在玉米中同源序列进行了定位。结果表明：ras探针在第2号和第7号染色体上均检出了杂交信号。A.在第2和第7号染色体长臂同时检出ras探针杂交信号；B.在2条第7号染色体长臂同时检出ras探针杂交信号；Ras基因：促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的原癌基因第67页，共93页，星期日，2025年，2月5日C.ras探针杂交信号在第7号染色体长臂上；D.ras探针杂交信号在第2号染色体长臂上；第68页，共93页，星期日，2025年，2月5日Northern印迹杂交是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固—液相杂交，以检测RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本过程与Southern印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。（二）Northern印迹杂交1.靶核酸——RNA2.RNA电泳——在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单链线性状态）3.转膜——电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛细管虹吸法等方法转移。第29页，共93页，星期日，2025年，2月5日（三）斑点及狭缝印迹杂交特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹(dotblot)。如印迹是线状则为狭缝印迹或狭线印迹(slotblot）第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日（四）原位杂交核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交（insituhybridization）。这是一种标记DNA与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。特点：（1）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；（4）可检测多个探针。核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日1.组织或细胞的固定2.组织细胞杂交前的预处理（预杂交）3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测重点介绍荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。种类：A.RNA酶保护分析法(RNaseprotectionassay,RPA)用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。（五）液相杂交1.制备待测RNA;2.RNA探针的标记3.杂交;4.除去单链RNA5.电泳分析第33页，共93页，星期日，2025年，2月5日B.核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay)用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。其原理与RNA酶保护分析法类似.第34页，共93页，星期日，2025年，2月5日1.cDNA探针：逆转录→cDNA→克隆于载体→扩增重组质粒→提取质粒→消化重组质粒→切割cDNA片段→分离纯化→cDNA探针cDNA探针应用最广泛2.基因组DNA探针：从基因组文库→