重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选培训课件.pptVIP

重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选;第一节???????重组DNA向宿主细胞的导入

第二节???????转化子的筛选与鉴定

第三节???????目的基因序列测定

;第一节???????重组DNA向宿主细胞的导入

;一、转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞;㈠原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。

㈡化学转化法:1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。

1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。

用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-).

2.方法:

（1）感受态细菌的制备（2）转化;（1）感受态细菌的制备

接种一环DH5?于2mlLB中37℃，振荡过夜

以约1%的接种量接入20mlLB中

振荡培养约90’至OD600≈0.2离心（5K，5’）收集菌体加入预冷CaCl2（10ml100mM）冰