半薄超薄切片技术.pptVIP

常用的染色剂:醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法：(1)组织块染色在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。?▲超薄切片染色第30页，共46页，星期日，2025年，2月5日(2)超薄切片后染色醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染铀染:细胞核及结缔组织染色铅染:提高细胞质成分的反差第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积）3%戊二醛in0.1MPBS,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存2）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次3）后固定1%锇酸固定in0.1MPBS，4°Covernight4）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C,overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置换乙醇：乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次，每级20-30分钟6）渗透丙酮:树脂=2:1，1:1（可以停下了，overnight），1:22-3h/级纯树脂12h，换纯树脂12h（从进入树脂开始更要严格防潮！）7）包埋聚合60°C24hr注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in0.1MPBSPh7.2第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日超薄切片图片第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日第1页，共46页，星期日，2025年，2月5日背景：肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2μm0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察半薄切片观察超薄切片第2页，共46页，星期日，2025年，2月5日半薄切片超薄切片？第3页，共46页，星期日，2025年，2月5日一、超薄切片技术介绍

第4页，共46页，星期日，2025年，2月5日固定地好渗透包埋地好切地好载网膜做地好染地好超薄切片的基本要求:第5页，共46页，星期日，2025年，2月5日超薄切片主要步骤★取材★固定★漂洗、脱水★渗透、包埋★超薄切片★超薄切片染色每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败第6页，共46页，星期日，2025年，2月5日1取材1.1取材的基本要求?(1)动作迅速，取材后快速放入固定液中；(2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。(3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。(4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。(5)取材部位要准确。第7页，共46页，星期日，2025年，2月5日1.2取材方法材料放在洁净的韧性较大的纸上滴上预冷的固定液用刀片将组织切下并修小用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。第8页，共46页，星期日，2025年，2月5日2固定(抽气)2.1?固定的目的︾采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。︾目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。︾良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。第9页，共46页，星期日，2025年，2月5日2.2常用固定剂

(1)四氧化锇(OsO4)--OSMIUMTETRAOXIDE※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白；※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜；●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难；●锇酸固定液常用浓度：1％－2％; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!第