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基因芯片筛选骨肉瘤相关长链非编码RNA的初步验证与分析

一、引言

1.1研究背景与意义

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童及青少年，发病率约为百万分之三，在小儿肿瘤中占比达5%。其发病部位多集中于肢体长管状骨干骺端，如股骨远端、胫骨近端等，也可见于盆骨、脊柱、下颚等部位。骨肉瘤的恶性程度极高，早期就容易发生转移，常见的转移部位为肺部。一旦确诊，约80%的患者已发生肿瘤转移，这使得治疗难度大幅增加。目前，临床上对于骨肉瘤的治疗主要包括手术切除、化疗和放疗等手段。然而，由于骨肉瘤的病因和发病机制尚未完全明确，这些治疗方法的效果仍不尽人意，患者的5年生存率仅为55%-65%，并发肺转移者2年生存率不到25%。因此，深入研究骨肉瘤的发病机制，寻找有效的诊断和治疗靶点，具有重要的临床意义。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。但近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在肿瘤的发生发展中发挥着关键作用。lncRNA可以通过与蛋白质、mRNA、miRNA等相互作用，影响基因的表达和信号通路的传导，从而调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学行为。在骨肉瘤中，已有研究发现多种lncRNA的表达异常，且与骨肉瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。因此，研究骨肉瘤相关的lncRNA，有望为骨肉瘤的诊断、治疗和预后评估提供新的思路和方法。

基因芯片技术是一种高通量的基因表达分析技术，它可以同时对成千上万的基因进行检测，具有高效、高信息量的特点。通过基因芯片技术，可以筛选出在骨肉瘤组织和正常组织中差异表达的lncRNA，为进一步研究这些lncRNA在骨肉瘤中的作用机制奠定基础。本研究旨在利用基因芯片技术筛选与骨肉瘤相关的lncRNA，并对其进行初步验证，以期为揭示骨肉瘤的发病机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。

1.2国内外研究现状

在骨肉瘤相关lncRNA的研究方面，国内外学者已取得了一定的进展。国内研究团队通过对骨肉瘤组织和癌旁组织的高通量测序，发现了多个差异表达的lncRNA，并对其功能进行了初步探索。有研究表明，lncRNAUCA1在骨肉瘤组织中表达上调，通过调控miR-143-3p/BCL2轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移；lncRNAHOTAIR在骨肉瘤中高表达，与肿瘤的恶性程度和预后不良相关，其机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

国外研究也发现了一些与骨肉瘤相关的lncRNA。如lncRNAMALAT1在骨肉瘤患者血清中表达水平显著升高，且与肿瘤大小及远处转移相关，联合血清MALAT1和碱性磷酸酶（ALP）检测可提高骨肉瘤的诊断敏感度和特异度；lncRNAFTX高表达与骨肉瘤淋巴血管浸润和临床分期有关，通过转染lncRNAFtx可增强人骨肉瘤细胞株的迁移和侵袭能力。

在基因芯片技术筛选骨肉瘤相关lncRNA方面，已有研究利用基因芯片技术对骨肉瘤组织和正常组织进行检测，筛选出了大量差异表达的lncRNA，并通过生物信息学分析对这些lncRNA的功能进行了预测。但目前对于这些差异表达lncRNA的验证和功能研究还相对较少，大部分lncRNA在骨肉瘤中的具体作用机制仍不明确。此外，不同研究之间筛选出的骨肉瘤相关lncRNA存在一定差异，这可能与实验样本、实验方法及数据分析方法的不同有关。

1.3研究目标与内容

本研究的目标是利用基因芯片技术筛选与骨肉瘤相关的lncRNA，并对其进行初步验证，为进一步研究骨肉瘤的发病机制和寻找新的治疗靶点提供基础。

具体研究内容包括：首先，收集骨肉瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织样本，提取总RNA，进行质量检测和浓度测定。然后，将合格的RNA样本进行反转录合成cDNA，再进行荧光标记，与基因芯片进行杂交，通过扫描芯片获取基因表达数据。接着，对基因表达数据进行分析，筛选出在骨肉瘤组织和癌旁正常组织中差异表达的lncRNA，并对这些差异表达lncRNA进行生物信息学分析，包括基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，预测其可能参与的生物学过程和信号通路。之后，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对基因芯片筛选出的部分差异表达lncRNA进行验证，以确定基因芯片结果的可靠性。最后，构建骨肉瘤细胞模型，通过细胞转染技术上调或下调差异表达lncRNA的表达水平，观察其对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响，初步探