实验四电泳技术及讲课文档.pptVIP

实验四电泳技术及;（优选）实验四电泳技术及;+;二、电泳迁移率;当分子达到动态平衡时，F=f

即QE=6πrηv

移项得v/E=Q/6πrη

v/E:表示单位电场强度时粒子运动速度，称

为迁移率，也称电泳速度，以?表示。

因此上式也可表示为：?=Q/6πrη;三、影响迁移率的因素;3.溶液的离子强度

缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢

一般在0.02-0.2mol/L。

4.电渗现象

在电场中液体对固体支持物的相对移动。

电泳介质多孔，且带有可解离的化学基团，

吸附正离子或负离子，使溶液相对带电。

应尽量避免选用有电渗作用的支持物。;四、电泳的分类;根据支持介质物理形状不同

（1）滤纸及其它纤维素薄膜电泳

（2）凝胶电泳

（3）粉末电泳

（4）线丝电泳

根据支持介质的装置形式

（1）平板式电泳

（2）垂直板式电泳

（3）连续式电泳

（4）圆盘电泳

根据pH连续性与否

（1）连续pH电泳

（2）非连续pH电泳;琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。

琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很

小的分子筛效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的

分离、纯化及检测。其分辨率较高。

聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质;五、琼脂糖凝胶电泳;电极缓冲液

TAE:

40mM/LTris-醋酸1mM/LEDTA

5×:24.2克Tris

5.7ml冰醋酸

10ml0.5M/LEDTA

TBE:

45mM/LTris-硼酸1mM/LEDTA

5×:54克Tris

27.5克硼酸

10ml0.5M/LEDTA;琼脂糖凝胶电泳优点：

1.双重效应：电泳效应、分子筛效应。

2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。

3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

4.凝胶透明且无紫外吸收，可在紫外灯下观看结果。

5.易染色，易洗脱，便于定量。

琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析。;琼脂糖凝胶分离范围

琼脂糖浓度%线状DNA分子分离范围Kb

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-3

2.00.1-2;第十五页，共45页。;六、等点聚焦

1.用两性电解质建立电场中连续线性pH梯度

2.只适用于两性解离的物质电泳;第十七页，共45页。;第十八页，共45页。;七、双向电泳

(2-DE);蛋白印迹(westernblotting)检测血清中的免疫球蛋白;一、概念;制备蛋白样品

SDS

转膜

免疫学检测;1.蛋白样品的获得;聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）聚合交联成三维网状

结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺

凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简

称PAGE）。PAGE灵敏度高（ug），分辨率高（几个bp）。

PAGE电泳体系中加入SDS--→SDS

PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分

子的分离、定性、定量及少量制备，还可测定分子量、

等电点等。;2.1聚丙烯酰胺凝胶的优点;分子量范围与凝胶浓度的关系;2.2聚丙烯酰胺凝胶的制备;影响聚合反应的因素：

（1）大气氧能淬灭自由基，抑制聚合。在进行化

学聚合前，一般在胶液表面，覆盖一层水或

溶液，隔绝空气，可加速聚合。

（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。

（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金

属等可抑制聚合反应。

（4）过硫酸铵易潮解失效。;2.3SDS分离蛋白的原理;SDS分离蛋白的特点;2.4十二烷基磺酸钠（SDS）的作用;3.转膜实现蛋白从凝胶到膜的转移;4.免疫学检测;SDS-;三、仪器、原料和试剂;第三十六页，共45页。;四