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川桑中桑皮素含量测定及其对特定癌细胞抑制作用的研究

一、引言

1.1研究背景与意义

桑树在植物分类学上属于桑科（Moraceae）桑属（MorusL.），是一种广泛分布且具有重要经济价值的植物。其叶、根、树皮等部位均含有多种生物活性成分，在传统医学和现代医药研究领域都备受关注。桑皮素（Morusin）作为桑树皮中主要的黄酮类成分之一，展现出了多样且强大的生物活性。

在抗肿瘤方面，桑皮素能够通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。研究表明，桑皮素可以诱导肿瘤细胞凋亡，如在对人前列腺癌Du145细胞的研究中，发现桑皮素能够抑制Du145细胞的生长，并诱导其发生凋亡，作用24h后IC50=16.5μmol/L，随着桑皮素作用浓度的增加，Hh信号通路中Gli1和VEGF因子的表达明显下降，从而发挥抗癌作用。在抗炎方面，桑皮素能够抑制炎症介质的释放和调节免疫细胞的活性，进而减轻炎症反应。在抗氧化方面，桑皮素可以清除自由基和抑制脂质过氧化反应，保护细胞免受氧化损伤。此外，桑皮素还被发现对于一些神经退行性疾病的治疗具有一定的潜力，如能够抑制阿尔茨海默病中与神经细胞死亡相关的蛋白质酶激活因子1（caspase-1）的活性，抵抗帕金森病中因氧化应激引起的神经细胞毒性。

川桑（MorusnotabilisSchneid）是桑属植物中的一种，为国家二级重点保护珍稀野生植物，目前仅在四川省雅安市荥经县原始森林发现10余株，其在科研和杂交繁育优良品种上具有很高的研究价值。然而，相较于其他常见桑树品种，对川桑中桑皮素的含量及其生物活性，尤其是抗肿瘤作用的研究还相对较少。

食管癌和前列腺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤。食管癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一，人食管癌ECA109细胞株常被用于食管癌的相关研究；前列腺癌在男性泌尿系统肿瘤中的发病率也呈上升趋势，Du145细胞株是研究前列腺癌的常用细胞模型。深入研究川桑中桑皮素的含量测定方法及其对人食管癌ECA109和前列腺癌Du145细胞株的抑制作用，不仅有助于进一步了解川桑的药用价值，为其合理开发利用提供科学依据，而且可能为食管癌和前列腺癌的治疗提供新的潜在药物来源和治疗思路，在药物开发和癌症治疗领域具有重要的理论和实践意义。

1.2研究目的与内容

本研究旨在测定川桑中桑皮素的含量，并深入探究其对人食管癌ECA109和前列腺癌Du145细胞株的抑制作用，为桑皮素作为潜在抗肿瘤药物的开发提供基础数据。主要研究内容如下：

川桑中桑皮素含量的测定：通过采集川桑样本，运用合适的提取方法和高效液相色谱法（HPLC），对川桑中的桑皮素含量进行精确测定，建立可靠的含量测定方法。

桑皮素对ECA109和Du145细胞株生长抑制作用的研究：采用MTT法检测不同浓度桑皮素作用于ECA109和Du145细胞株后的细胞增殖情况，分析桑皮素对两种癌细胞生长的抑制效果及剂量-效应关系。

桑皮素对ECA109和Du145细胞株凋亡的影响：运用流式细胞术检测桑皮素处理后细胞的凋亡率，观察桑皮素是否通过诱导细胞凋亡来抑制癌细胞生长。

桑皮素对ECA109和Du145细胞株周期的影响：同样利用流式细胞术分析桑皮素对细胞周期分布的影响，探讨桑皮素抑制癌细胞生长的细胞周期相关机制。

1.3研究方法与技术路线

研究方法

高效液相色谱法测定桑皮素含量：将川桑样品进行预处理后，采用高效液相色谱仪进行分析。通过优化色谱条件，如选择合适的色谱柱（如YMC-PackODS-A色谱柱5μm，4.6mm×250mm）、流动相（甲醇-水或甲醇-0.1%磷酸水溶液等不同比例）、柱温、流速和检测波长（如检测波长268nm或350nm等），实现对桑皮素的准确分离和定量测定。

MTT法检测细胞增殖：将ECA109和Du145细胞株以一定密度接种于96孔板，培养24h后加入不同浓度的桑皮素药物继续培养72h。之后加入MTT溶液孵育2h，再用DMSO溶解形成的甲瓒晶体，通过酶标仪测定各孔在特定波长下的吸光度（A值），计算细胞生长抑制率，以评估桑皮素对细胞增殖的影响。

流式细胞术检测细胞凋亡和周期：收集经桑皮素处理后的ECA109和Du145细胞，用相应的染色试剂（如AnnexinV-FITC/PI双染试剂用于检测细胞凋亡，PI单染用于检测细胞周期）进行染色，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布情况，分析桑皮素对细胞凋亡和周期的影响。

技术路线：见图1-1。

川桑样品采集与预处理：在四川省雅安市荥经县采集川桑样本，洗净、干燥后粉碎备用。

桑皮素提取：采用合适的提取方法