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PEDV经典株与流行株S基因N端片段抗原性剖析及单克隆抗体的匠心制备

一、引言

1.1研究背景

猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病。该病主要感染猪，尤其是仔猪，临床症状表现为呕吐、水样腹泻、脱水，严重时可导致仔猪100%死亡，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。

自1971年英国首次报道PED以来，该病已在世界多个国家和地区广泛传播。1976年，中国大陆首次报道PED的发生与流行，此后，PED在我国的流行呈上升趋势。特别是2010年以来，猪流行性腹泻病在全国大部分主要养殖区暴发，初生仔猪死亡率高达90%以上，全国仔猪死亡估计达上千万头，对我国生猪养殖业造成了难以估量的损失。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，基因组为单股正链具有感染性的RNA，大小约为28kb。其基因组包含6个开放阅读框（ORF），从5’→3’端依次为ORF1、S基因、ORF3、E基因、M基因、N基因，分别编码结构蛋白S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白。其中，S基因编码的S蛋白是一种跨膜糖蛋白，位于病毒表面，在病毒与细胞受体结合、病毒融合以及诱导中和抗体方面发挥着关键作用。

随着分子生物学技术的发展，对PEDV的研究不断深入。研究发现，PEDV的S基因存在一定的变异，不同毒株之间的S基因序列存在差异，这可能导致病毒抗原性的改变。PEDV经典株和流行株在S基因上的差异尤为明显，这些差异可能影响病毒的传播能力、致病性以及疫苗的免疫效果。因此，研究PEDV经典株和流行株S基因N端片段的抗原性差异，对于深入了解PEDV的分子流行病学特征、开发有效的诊断方法和疫苗具有重要意义。

1.2研究目的和意义

本研究旨在通过原核表达PEDV经典株和流行株S基因N端片段，比较它们的抗原性差异，并制备针对这两个片段的单克隆抗体。具体目的如下：

比较抗原性差异：通过原核表达技术获得PEDV经典株和流行株S基因N端片段的重组蛋白，利用SDS电泳、Westernblot及ELISA等方法对其进行纯化及验证，然后比较这两个片段的抗原性差异，为进一步研究PEDV的免疫机制和疫苗研发提供基础数据。

制备单克隆抗体：选取合适的小鼠作为免疫动物，免疫原核表达的PEDV经典株和流行株S基因N端片段，制备多克隆抗体。再使用细胞融合技术，制备针对这两个片段的单克隆抗体，并对其特异性和敏感性进行检测，为PEDV的检测方法、诊断技术及疫苗研发提供技术支持。

本研究的意义在于：

理论意义：深入了解PEDV经典株和流行株S基因N端片段的抗原性差异，有助于揭示PEDV的遗传变异规律和免疫逃逸机制，丰富对PEDV分子生物学特性的认识，为PEDV的基础研究提供理论依据。

实际应用价值：制备的单克隆抗体可用于建立高灵敏度、高特异性的PEDV检测方法，如ELISA、免疫荧光等，有助于PEDV的早期诊断和疫情监测。此外，单克隆抗体还可作为研究工具，用于分析PEDV与宿主细胞的相互作用机制，为开发新型疫苗和治疗药物提供技术支持，从而有效防控PED的发生和传播，减少其对养猪业造成的经济损失。

二、PEDV及S基因N端片段概述

2.1PEDV介绍

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引发猪流行性腹泻的病原体，在分类上属于冠状病毒科冠状病毒属。其病毒粒子呈现多形性，多数为球形，直径处于95-190nm之间，平均直径约130nm。该病毒具有囊膜，囊膜上分布着长18-23nm的纤突，呈放射状由内向外排列，这些纤突在病毒的感染过程中发挥着重要作用，如与宿主细胞受体结合，介导病毒进入宿主细胞。

PEDV的基因组为单股正链RNA，长度约28kb，5’端具有帽子结构，3’端带有poly(A)尾巴，包含至少7个开放阅读框（ORF）。从5’到3’端依次为ORF1、S基因、ORF3、E基因、M基因、N基因，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。其中，非结构蛋白参与病毒的复制和转录过程，而结构蛋白则构成病毒的外壳和内部结构，维持病毒的形态和稳定性。

PEDV对养猪业的影响极其严重。自1971年在英国首次被报道以来，已在全球多个国家和地区广泛传播。PED主要通过粪-口途径传播，不同年龄和品种的猪均易感，但仔猪，尤其是哺乳仔猪感染后病情最为严重，发病率和死亡率可高达100%。感染PEDV的仔猪会出现呕吐、水样腹泻、脱水