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DNA提取原理和方法;细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子,均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子;后者为双链环状分子。
除此之外,在原核生物中还有双链环状的质粒DNA;在非细胞型病毒颗粒内,DNA的存在形式多种多样。;极性化合物,溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,钠盐比游离核酸易溶于水。
在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
;提取DNA总的原则:
;DNA提取的几种方法;基因组DNA的提取;吸附材料结合法:;浓盐法:
有机溶剂抽提法:
密度梯度离心法:
;SDS法流程图(以动物组织为例);Phenol-chloroformextractionofmousetail?DNA;1.SDS:十二烷基硫酸钠;3.MoreProteinaseKmaybeaddedifdigestionisnotcompleteafter24hr;
;4.Add0.5mlPhenol/Chloroformandvortexattopspeedfor15minatRT;
5.Spinat13,000rpmfor30minatRT;
;;10.Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube,add50ml3MNaOAc(pH=6.0)and0.5ml100%ethanol,invertseveraltimes;
11.Spinat13,000rpmfor5minatRT;;DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。
2.基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。;非基因组DNA的提取;1、培养细菌使质粒扩增---对数生长后期
2、收集和裂解细菌
3、质粒DNA的纯化
;1、培养细菌使质粒扩增---对数生长后期
在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆),使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。
;2、收集和裂解细菌
非离子型/离子型去污剂
裂解有机溶剂/碱
加热
;3、质粒DNA的纯化
---CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量;原理;离心洗涤;SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用;溶液ⅡLysisBuffer
成分:0.2MNaOH/1%SDS
NaOH:溶解细胞,DNA变性
SDS:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
(2)解聚细胞中的核蛋白。
(3)SDS能与蛋白质结合成为复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。
SDS与NaOH联用:增强NaOH的强碱性
;SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用;吸附柱SpinColumnwithCollectionTubes;大提小提;*内毒素的去除;原理;是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。;谢谢大家!
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