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动物细胞学融合实验教案

一、实验目的

1.掌握动物细胞融合的基本原理和常用方法，加深对细胞膜流动性的理解。

2.熟悉聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的操作流程。

3.学会观察和判断细胞融合的现象及融合效率。

4.培养无菌操作意识、精细操作技能以及实验结果分析能力。

二、实验原理

细胞融合是指两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。在自然生理状态下，受精过程即是一种细胞融合现象。在实验室条件下，可通过物理（如电融合）、化学或生物（如病毒诱导）方法促使细胞发生融合。

本实验采用化学诱导法，以聚乙二醇（PEG）作为融合剂。PEG具有强烈的吸水作用，能破坏细胞膜的水化层，使细胞膜磷脂分子结构发生紊乱，导致细胞膜局部区域出现疏水区域。当两个细胞相互靠近时，这些疏水区域会相互作用，促使细胞膜融合，随后细胞质流通，最终形成一个含有多个细胞核的融合细胞（异核体）。PEG的分子量、浓度、处理时间以及温度等因素均会显著影响融合效率。

三、实验材料与试剂

（一）实验材料

1.细胞株：选用两种易于区分的动物细胞，如小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞（或选用不同染色标记的细胞，如一种用台盼蓝染色，另一种不染色，或选用形态差异较大的两种细胞）。

2.实验动物：若涉及原代细胞分离，可选用适龄小鼠等（根据具体细胞来源确定）。

（二）主要试剂

1.基础培养液：如RPMI-1640培养液或DMEM培养液（根据所用细胞株选择）。

2.完全培养液：基础培养液添加适量胎牛血清（如10%-20%）及双抗（青霉素、链霉素）。

3.无血清培养液：基础培养液，用于融合前洗涤细胞，避免血清对PEG作用的干扰。

4.聚乙二醇（PEG）溶液：称取适量PEG（分子量可选，如常用的PEG1000或PEG4000），在水浴中加热使其融化，用温热的无血清培养液或Hanks液配制成一定浓度（通常为40%-50%）的溶液，用NaHCO?调整pH至中性偏碱（约7.4-7.6），过滤除菌后分装，-20℃保存备用。使用前需预热至37℃。

5.Hanks平衡盐溶液（HBSS）或磷酸缓冲盐溶液（PBS）：用于洗涤细胞。

6.0.25%胰蛋白酶溶液：用于贴壁细胞的消化传代。

7.台盼蓝染液（0.4%）：用于检测细胞活力。

8.Giemsa染液：用于融合细胞的染色观察。

（三）实验仪器与器材

1.超净工作台

2.二氧化碳培养箱

3.倒置显微镜

4.离心机

5.恒温水浴锅

6.冰箱

7.微量移液器及配套吸头

8.离心管（15mL,5mL）

9.培养皿或培养板

10.载玻片、盖玻片

11.废液缸、酒精棉球、记号笔等

四、实验步骤

（一）实验准备

1.试剂准备：提前将PEG溶液、无血清培养液、Hanks液等从冰箱取出，在37℃水浴锅中预热。

2.细胞准备：

*选取生长状态良好的两种待融合细胞（分别标记为细胞A和细胞B）。若为贴壁细胞，用胰蛋白酶消化后，收集至含完全培养液的离心管中；若为悬浮细胞，直接将细胞悬液转移至离心管。

*取适量细胞悬液，用台盼蓝染色计数，确保细胞活力在90%以上。

（二）细胞收集与洗涤

1.分别离心：将细胞A和细胞B的悬液分别装入15mL离心管中，以中等转速离心（具体离心参数根据细胞类型调整），5-10分钟，弃上清液。

2.混合与洗涤：

*向其中一管细胞沉淀中加入少量无血清培养液，轻轻吹打使细胞重悬。

*将此细胞悬液转移至另一管细胞沉淀中，使两种细胞充分混合。

*加入适量无血清培养液至10mL，轻轻吹打混匀。

*再次以相同转速离心5-10分钟，弃上清液。

*用无血清培养液重复洗涤1-2次，以彻底去除血清。最后一次离心后，尽量吸净上清液，保留细胞沉淀。

（三）PEG诱导细胞融合

1.细胞重悬：用手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散均匀。

2.PEG处理：在37℃水浴条件下，用微量移液器缓慢向离心管中逐滴加入预热的PEG溶液（约0.5-1mL，根据细胞量调整，确保PEG最终浓度适宜），边加边轻轻转动离心管，使PEG与细胞充分接触，作用时间严格控制在1-2分钟（此步是关键，时间过长会导致细胞大量死亡，过短则融合效率低）。

3.终止PEG作用：在37℃水浴条件下，缓慢加入预热的无血清培养液以终止PEG的作用。先加入1mL，轻轻混匀，静置1分钟；再逐滴加入2mL，混匀；随后逐步加入至10mL，边加边轻轻吹打，整个过程约5-10分钟，以减少PEG对细胞的毒性。

（四）融合后培养与观察

1.离心收集融合细胞：将上述混合液以较低转速离心（较步骤二中离心转速略低）5-10分钟，弃上清液，避免用力吹打，防止融合的细胞团分散。