重组子鉴定方法详解.pptx

第二节重组子的鉴定

利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、鉴定质粒大小分离质粒，电泳、比较其分子量。Marker载体重组载体载体重组载体载体Marker重组载体载体

二、酶切电泳筛选法根据已知的重组DNA分子的限制性酶切图谱选择一两种内切酶进行酶切凝胶电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度），是否有外源DNA的插入。

三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。2.过程设计引物扩增模板序列电泳检测条带大小

一、原理重组克隆转化子与探针杂交。32P（1）放射性同位素探针：人为加上可方便检测的标记物的特定核苷酸片段。（2）非放射性标记荧光素四、核酸分子杂交法

核酸种类：DNA探针,RNA探针检测方法：显色反应,化学发光,放射性曝光

（一）、Southern印迹杂交（二）、Northern印迹杂交

（三）、斑点印迹杂交（四）、菌落（或噬菌斑）印迹杂交

二、核酸杂交的类型

（一）、Southern印迹杂交原理：根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，又称为DNA印迹杂交技术。

（二）、Northernhybridization1、原理指根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移RNA片段，称为RNA印迹杂交技术。

（三）、斑点印迹杂交原理：在Southern杂交的基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂交检测。该方法使用特殊的加样装置-多孔过滤进样器，可使众多待测样品一次同步转移到一张膜上，并有规律地排列成点阵，所以称为斑点印迹杂交。

（四）、菌落（或噬菌斑）印迹杂交原理：将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，是溶菌变性的DNA同滤膜原位结合，然后进行杂交检测。杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标序列的菌落或噬菌斑。