植物原生质体融合体细胞杂交.pdfVIP

植物组织培养

培黎职业学院现代农业学院

模块六拓展知识

1.原生质体融合与体细胞杂交

2.种质保存

3.创意组培

项目一原生质体融合与体细

胞杂交

我们知道原生质体指的是用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力

的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁，它具有活细胞的一切特征。通

过大量的实验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能性”，可以经过离体

培养得到再生植株。目前已有49个科160个属的360多种植物经原生质体培养得到

了再生植株。

原生质体融合与体细胞杂交

一、材料来源和预处理

（一）材料来源

供体材料是影响原生质体培养成功与否的关键因素之一，不但影响原

生质体分离的效果，也影响原生质体的培养效果。一般来说根、茎、叶

、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材

料。目前较多采用叶片来分离原生质体，其叶肉组织是游离原生质体的

一种良好材料，但分裂旺盛、再生能力强的愈伤组织或悬浮细胞、尤其

是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。

（二）材料的预处理

为提高原生质体的产率和活性，逐步提高植物材料的渗透压，以适应

培养基中的高渗环境，进行原生质体分离前要进行预处理，包括低温处

理和等渗溶液处理。

原生质体融合与体细胞杂交

二、原生质体的分离

（一）机械法

⚫步骤：使细胞质壁分离→切开细胞壁→获得原生质体。

⚫其优点是它能够排除外加酶对离体的原生质体的结构与代谢活性的有害影

响。但原生质体的产量低，方法繁琐费力，因此没有得到广泛的应用。

（二）酶法

（1）确定酶的种类

分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

（2）分离方法

酶分离法可分为一步法和两步法。

原生质体融合与体细胞杂交

三、原生质体的纯化

➢纯化的原因：

酶解后的混合物包括解离酶液中有原生质体、破碎细胞的细胞器等，

也有未解离的组织或细胞，因此要进行纯化，获得纯净的原生质体。

方法

离心沉淀法漂浮法界面法

原生质体融合与体细胞杂交

四、原生质体的活力测定

原生质体的活力强弱是原生质培养成功与否的关键因素之一。了解

分离提纯的原生质体的活力，对修正酶液的组合和原生质体培养至关

重要。因此，在前期必须对原生质体的活力进行测定，主要的测定方

法有以下几种:

➢目测法

➢荧光素二乙酸法（FDA）

➢酚藏花红染色法

原生质体融合与体细胞杂交

五、原生质体培养的方法与条件

（一）原生质体培养方法

➢液体浅层培养

该方法使用液体培养基进行原生质体培养。

➢平板培养法

➢液体-固体双层培养

该种方法是原生质体培养所有方法中效果最好的，即在培养皿底部

铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。

➢悬滴培养法

➢饲喂层培养

原生质体融合与体细胞杂交

五、原生质体培养的方法与条件

（二）原生质体培养的条件

⚫原生质体的培养基

在多数情况下原生质体所用的基本培养基为MS、B、N等。

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⚫光照

原生质体初期培养一般不需要光照，一般采用暗培养。

⚫温度

原生质体培养温度一般为27~29℃，因植物种类不同而有所差异，一

般来说热带植物要求温度稍高，寒带植物要求温度稍低。

原生质体融合与体细胞杂交

使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合

成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术就是原生质体

融合也叫做体细胞杂交。

植物原生质