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蛋白质测定BCA法实验操作手册

一、引言

蛋白质浓度测定是生命科学研究中最基础、最常用的实验技术之一，其结果的准确性直接影响后续实验的可靠性。BCA（BicinchoninicAcid）法，即二喹啉甲酸法，凭借其操作简便、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力较强以及对不同类型蛋白质兼容性好等特点，被广泛应用于各种生物样品中总蛋白质浓度的定量分析。本手册旨在提供一份详尽、规范的BCA法蛋白质测定实验操作指南，以期为科研工作者提供实用的技术参考，确保实验结果的精确与可重复。

二、实验原理

BCA法测定蛋白质浓度的原理基于蛋白质与铜离子的显色反应。在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2?发生络合反应，使Cu2?还原为Cu?（此过程类似于Lowry法的第一步）。BCA试剂（二喹啉甲酸）作为一种稳定的显色剂，可与Cu?结合形成紫色的络合物。该络合物在562nm波长处具有最大光吸收，其吸光度值与蛋白质浓度在一定范围内呈正比关系。通过测定已知浓度的蛋白质标准品的吸光度，绘制标准曲线，即可根据未知样品的吸光度值计算出其蛋白质浓度。

三、实验材料与试剂

（一）主要仪器设备

1.分光光度计或酶标仪（配备562nm波长）

2.恒温水浴锅或恒温培养箱

3.微量移液器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套吸头

4.离心管（1.5mL、15mL、50mL）

5.96孔酶标板（平底，聚苯乙烯材质）

6.涡旋混匀器

7.离心机

8.分析天平

9.超净工作台（若处理生物样品）

（二）主要试剂

1.BCA蛋白定量试剂盒（通常包含A液和B液）

*BCA试剂A液：含有硫酸铜、柠檬酸钠、碳酸钠等。

*BCA试剂B液：含有BCA钠盐、氢氧化钠、酒石酸钾钠等。

2.蛋白质标准品：通常为牛血清白蛋白（BSA），浓度一般为已知的较高浓度（如1mg/mL或2mg/mL）。

3.样品稀释液/PBS缓冲液（PhosphateBufferedSaline）：用于稀释标准品和待测样品，避免样品基质干扰。

4.细胞裂解液/组织匀浆液（根据样品类型选择，用于从生物样品中提取蛋白质）

5.去离子水或超纯水

四、试剂配制

（一）BCA工作液的配制

1.阅读试剂盒说明书，确定BCA试剂A液与B液的混合比例（通常为50:1或100:1，具体比例以试剂盒说明书为准）。

2.根据实验所需的总工作量（标准品孔数+样品孔数+复孔数+预留）计算所需BCA工作液的总体积。

3.在洁净的试剂瓶中，按比例混合BCA试剂A液和B液，充分混匀。

*例如：若需配制10mL工作液，按A:B=50:1，则取9.8mLA液和0.2mLB液混合。

4.BCA工作液应现用现配，配制好的工作液在室温避光条件下可稳定数小时。

（二）蛋白质标准品溶液的稀释（以1mg/mLBSA标准品为例，制备标准曲线）

1.准备一系列洁净的1.5mL离心管，标记为0μg/mL、Xμg/mL、Yμg/mL...（具体浓度梯度根据试剂盒推荐和样品预期浓度范围设定，常见梯度为0、125、250、500、750、1000μg/mL或0、200、400、600、800、1000μg/mL）。

2.向“0μg/mL”管中加入适量样品稀释液（如100μL）。

3.按照倍比稀释或梯度稀释的原则，用样品稀释液将1mg/mLBSA标准品稀释成所需的各个浓度梯度。

*例如：取50μL1mg/mLBSA标准品加入450μL稀释液中，得到100μL/mL的中间稀释液；再从此中间稀释液中取相应体积加入到不同离心管中，用稀释液补足至一定体积，得到所需浓度。

4.充分混匀各管标准品溶液，备用。

五、实验步骤

（一）样品准备

1.细胞样品：收集细胞，用预冷的PBS洗涤1-2次，加入适量细胞裂解液，冰上裂解（具体时间根据裂解液类型而定），离心（通常____g，4℃，10-15分钟），取上清即为待测蛋白质样品。

2.组织样品：将组织剪碎，加入预冷的PBS或组织匀浆液，冰上匀浆，离心，取上清。

3.血清/血浆样品：通常需要用稀释液进行较大倍数的稀释。

4.根据样品中预期蛋白质浓度，用样品稀释液将待测样品稀释至合适浓度范围（使其吸光度值落在标准曲线的线性范围内）。建议进行多个稀释倍数的尝试，以确保结果的可靠性。

（二）加样

1.取出96孔酶标板，在板上标记好标准品孔、样品孔及其复孔位置。

2.标准品加样：向标准品孔中分别加入不同浓度的BCA标准品溶液，每孔XμL（通常为10μL或20μL，具体体积根据试剂盒推荐和标准品浓度梯度调整）。例如，每孔加入20μL标准品溶液。“0μg/mL”孔加入等量的样品稀