农用芽孢杆菌发酵培养技术规程.docxVIP

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枯草芽孢杆菌对盐碱地生物改良技术规程

1范围

本文件规定了农用芽孢杆菌发酵培养技术的术语和定义、生产环境和设备要求、培养基、发酵工艺流程、指标检测和储运等内容。

本文件适用于农用芽孢杆菌发酵培养，微生物肥料生产企业和其他相关单位参照使用。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本使用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB3095环境空气质量标准

GB3838地表水环境质量标准

GB20287农用微生物菌剂

GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

GB/T41727农用微生物菌剂功能评价技术规程

NY/T1109微生物肥料生物安全通用技术准则

SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程

3术语和定义

GB20287、GB/T41727界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1农用芽孢杆菌Bacillusinoculantsappliedinagriculture

芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，一种需氧菌。菌体杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动。可形成内生抗逆芽孢，生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黄色。无致病性，并具有直接或间接改良土壤、恢复地力，维系根际微生物区系平衡，促进作物生长，调节作物抗逆，降解有毒、有害物质等作用，应用于农业生产，通过其中生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长、改善农产品品质及农业生态环境。

3.2菌种strain

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单一遗传背景、由单菌落来源，用于微生物扩繁或菌种资源保藏的培养物。按照来源、扩繁体积可以分为初级菌种、一级菌种、二级菌种等。

3.3溶解氧dissolvedoxygen

溶解在水中的空气中的分子态氧称为溶解氧，水中的溶解氧的含量与空气中氧的分压、水的温度都有密切关系，在发酵聚谷氨酸时所测值为溶解在发酵液中的分子态的氧被菌体消耗利用后的剩余含量。

4生产环境和设备要求

4.1生产环境

应符合如下条件：

——厂区空气质量达到GB3095中二类环境空气质量标准要求。

——发酵生产用水应符合GB3838中III类水质要求，其他用水应符合GB3838中IV类水质要求。——发酵生产场地及发酵相关设施应符合安全、环保、消防等条件要求。

——发酵生产场地需配置消毒灭菌设施。菌种储藏、无菌操作设备应与生产场地相对隔离并定期消毒。

4.2生产设备

采用不锈钢发酵罐，设备体积根据生产规模自定。主要生产设备有种子罐、液体发酵罐、补料罐、冷水机、配料机、空压机、蒸汽锅炉等。

5培养基

5.1一般要求

培养基所使用的原材料应满足菌液生产要求，具体按GB4789.28的规定执行。对于首次使用的发酵原料应通过摇瓶或小型发酵试验后再用于发酵生产。

5.2种子培养基

农用芽孢杆菌的初级菌种及一级菌种使用的种子培养基中应含有易被菌种吸收利用的碳氮源，营养丰富。种子培养基见附录A中的表A.1。

5.3发酵培养基

5.3.1发酵培养基原料主要包括淀粉、淀粉糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油等为主要碳源，豆粕粉、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵为氮源，适量的金属盐离子，碳酸钙等pH缓冲剂等。

5.3.2高含菌量发酵培养基配方需要以发酵菌量为目标，通过单因子实验、正交实验和响应面实验等实验优化培养基的原料和用量。

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5.3.3高活性代谢物发酵培养基配方需要以代谢产物合成量为目标，通过单因子实验、正交实验和响应面实验等实验优化培养基的原料和用量。

5.4固体培养基

用于农用芽孢菌种分离、鉴定及活菌计数使用。固体培养基见附录A中的表A.2。

6发酵工艺流程

6.1发酵生产流程

孢芽杆菌发酵生产流程见图1。

图1芽孢杆菌发酵生产流程图

6.2菌种要求

农用芽孢杆菌菌种应符合GB20287、GB/T41727和NY/T1109的要求。菌种保藏应按照SN/T2632的要求。

6.3灭菌方法

种子培养基、发酵培养基、固体培养基、菌种培养器材、发酵罐等均需采用高压湿热灭菌，灭菌条

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件为115℃~121℃,0.1MPa～0.15MPa，灭菌20min～30min。灭菌后无菌操作取培养基染色镜检，无微生物说明灭菌彻底。

6.4接种方法

在超净工作台内，采用接种针经火焰灭菌,待冷却后沾取少量初级菌种，转接至装有种子培养基的三角瓶内，完成一级菌种的接种。一级菌种培养好后，转移到无菌接种钢瓶中，