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伯氏疟原虫PbK173株对青蒿素与哌喹的抗性培育及K13基因多态性解析

一、引言

1.1研究背景与意义

疟疾，作为一种古老且极具危害性的寄生虫病，长期以来严重威胁着人类的健康。据世界卫生组织（WHO）统计数据显示，全球每年仍有数以亿计的人感染疟疾，在非洲、亚洲以及拉丁美洲的部分地区，疟疾的发病率和死亡率居高不下。疟疾主要由疟原虫感染引起，通过按蚊叮咬传播，患者会出现周期性的发热、寒战、头痛、贫血等症状，严重时甚至会导致死亡，尤其对儿童、孕妇以及免疫力低下人群的危害更为显著。

青蒿素，作为从菊科植物黄花蒿叶中提取分离得到的含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，自被发现以来，因其能迅速杀灭红细胞内期疟原虫、毒性低且对抗氯喹恶性疟有显著疗效，成为了抗疟领域的关键药物。哌喹，同样是长效抗疟药，与青蒿素联合使用时，能够发挥协同作用，增强抗疟效果，同时延缓疟原虫抗药性的产生。基于青蒿素和哌喹的复方制剂在全球疟疾治疗中得到了广泛应用，拯救了无数生命。

然而，随着青蒿素和哌喹等抗疟药物的长期大量使用，疟原虫对这些药物的抗性问题日益凸显。疟原虫抗性的出现，使得原本有效的治疗方案效果大打折扣，导致疟疾治疗难度增加、复发率上升，严重影响了全球疟疾防控计划的实施。例如，在东南亚部分地区，已出现疟原虫对青蒿素产生抗性的现象，疟原虫清除速度明显放缓，治疗失败的案例逐渐增多。因此，深入研究疟原虫对青蒿素和哌喹的抗性培育过程，对于了解抗性产生机制、制定有效的抗疟策略至关重要。

K13基因作为与疟原虫对青蒿素抗性密切相关的基因，其多态性变化在抗性产生过程中扮演着关键角色。不同的K13基因突变类型可能导致疟原虫对青蒿素的敏感性发生改变。研究K13基因多态性，能够为监测疟原虫对青蒿素的抗性提供重要的分子生物学指标，有助于及时发现抗性疟原虫的出现和传播，为调整抗疟药物的使用策略提供科学依据，从而更有效地控制疟疾的传播和流行，保护人类健康，具有重大的公共卫生意义和社会经济价值。

1.2国内外研究现状

在国外，对于疟原虫对青蒿素和哌喹抗性培育的研究开展较早且较为深入。科研人员通过体外培养疟原虫并逐步增加药物浓度的方法，成功诱导出对青蒿素和哌喹具有不同抗性程度的疟原虫株，并对其抗性特征进行了详细分析。研究发现，抗性疟原虫在药物作用下，其代谢途径、膜转运蛋白等方面发生了显著变化，这些变化与抗性的产生密切相关。在K13基因多态性研究方面，通过对大量疟原虫样本的基因测序和分析，已经明确了多种与青蒿素抗性相关的K13基因突变位点，如A578S、R539T等突变在东南亚地区的抗性疟原虫中频繁出现，并通过分子生物学实验验证了这些突变对疟原虫青蒿素抗性的影响机制。

国内的相关研究也取得了丰硕成果。研究人员针对我国疟区的疟原虫进行了抗性监测和基因多态性分析，发现我国部分地区的疟原虫对青蒿素和哌喹也存在一定程度的抗性，且K13基因多态性呈现出地域分布特点。在抗性培育研究中，采用大剂量复燃法等方法对疟原虫进行抗性诱导，为深入了解抗性产生过程提供了实验依据。然而，目前国内外的研究仍存在一些不足之处。在抗性培育方面，对于抗性疟原虫在体内的传播和演化规律研究还不够全面；在K13基因多态性研究中，虽然明确了部分关键突变位点，但对于一些低频突变以及不同突变之间的协同作用了解甚少，这限制了我们对疟原虫抗性机制的全面认识，也给抗疟药物的研发和抗性防控带来了挑战。

1.3研究目标与内容

本研究旨在深入探究PbK173株疟原虫对青蒿素和哌喹的抗性培育过程，并详细分析其K13基因多态性特征，为抗疟药物的合理使用和疟疾防控策略的制定提供科学依据。具体研究内容包括：运用大剂量复燃法对PbK173株疟原虫进行青蒿素和哌喹的抗性培育，观察疟原虫在药物压力下的生长、繁殖情况以及抗性发展过程，测定不同培育阶段疟原虫对青蒿素和哌喹的半数抑制浓度（IC50），评估抗性程度的变化；采用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增PbK173株疟原虫的K13基因，通过基因测序分析K13基因的多态性，确定突变位点和突变类型，探讨K13基因多态性与疟原虫对青蒿素和哌喹抗性之间的关联；结合抗性培育和基因多态性分析结果，深入研究抗性产生的潜在机制，为开发新的抗疟药物和制定有效的抗性防控策略提供理论支持。

1.4研究方法与技术路线

本实验主要采用以下研究方法：大剂量复燃法用于PbK173株疟原虫对青蒿素和哌喹的抗性培育，通过对感染疟原虫的小鼠进行多次高剂量药物处理，观察疟原虫的复燃情况，逐步诱导其产生抗性；PCR技术用于扩增疟原虫的K13基因，通过设计特异性引物，在体外扩增目标基因片段，为后续的基因分析提供模板；基因测序技术对扩增得到的K13基因进行测序，确定基因序列中的突变位