实验专题计划书.docVIP

试验计划书（初定）

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xxxx年xx月xx号

此为初步计划书，还有很多不成熟甚至错误之处，望老师给指出！

=1\*ROMANI总体计划

本试验总体上分为三大步。（1）生理试验部分：本部分关键进行papaya硬度和细胞壁相关酶类活性测定。（2）分子试验部分：本部分关键是取得papaya细胞壁相关酶类基因序列和由RNA差异表示谱取得细胞壁代谢酶基因等表示特征。（3）验证试验部分：本部分关键经过实时荧光定量PCR方法(RealtimeQ-PCR)验证并初步确定和“橡皮化”相关细胞壁代谢酶基因家族组员。

生理试验部分是第一步需要实施，也是比较独立部分，初步定为40天左右时间结束。分子试验和验证试验部分是本试验关键，这两部分紧密结合，需要同时进行，首先是多种样本（CK，ETH，1-MCP)取得,随即是各样本RNA提取，然后委托深圳华大基因企业进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关基因序列,采取5RACE及3RACE方法,取得这些基因全长序列和构建差异表示谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析，最终经过实时荧光定量PCR方法(RealtimeQ-PCR)验证并初步确定和“橡皮化”相关细胞壁代谢酶基因家族组员。

=2\*ROMANII具体计划

一，买果。

二，采后预处理：

采后立即运回试验室，剔除病果和机械损伤果，选择形状、大小、外观颜色相对一致番木瓜果实，剪留0.5cm长果柄为试验材料。先用1.0g/L次氯酸钠溶液洗果10min，再用0.5g/L施保功溶液浸泡果实10min，取出晾干后备用。

三，样品分组（四组）：

1.对照组：果实用PE（聚乙烯）保鲜袋包装，轻绑袋口，置于低温（15℃）恒温箱中贮藏。

2.1.0μl/L1-MCP处理（橡皮化果实）：在室温条件下（25℃），用浓度1.0μl/L1-MCP密闭熏蒸处理果实24h，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH（相对湿度）为90%条件下贮藏。

3.0.5g/L乙烯利处理：在室温条件下（25℃），用浓度0.5g/L乙烯利处理果实3分钟，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH为90%条件下贮藏。

四，试验过程：

贮藏过程中每隔2d（催熟果实）和5d取样一次，鲜果或-70℃贮存，为以后进行基因表示水平研究。

取样同时，进行以下生理指标测定：

1.果实硬度：

使用果实硬度计（FHM-1型,日本产）进行测定。

2.PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性：

称取1g果肉，加入5mL(先加3mL,后用2mL冲洗)0.05mol/L，pH4.6柠檬酸缓冲液低温存放（含5%NaCl和1.8mMEDTA（乙二胺四乙酸）），冰浴研磨匀浆。然后在10000转离心30min，将上清液进行透析，用0.05mol/L，pH4.6柠檬酸缓冲液作为透析液，透析液不含EDTA和NaCl。透析条件：4℃条件下放二十四小时，中间换一次缓析液，透析完溶液用于酶活力测定。该操作在冰浴下进行。

PG活性测定：PG活性测定以1%多聚半乳糖醛酸(PGA,美国Sigma企业)为底物,反应混合液为：1%PGA0.5mL、醋酸钠缓冲液(pH4.6)1.5mL、酶提取液0.5mL,0.5mL水（总反应体系为3mL）,40℃反应60min,立即加入1mLDNS(3,5-二硝基水杨酸)终止反应。再加入沸水中煮沸10min后冷却，于波长540nm下定量分析酶水解生成半乳糖醛酸含量。以3mL蒸馏水+1mLDNS作为对照（CK）。以每小时释放1mgD-半乳糖醛酸(美国Sigma企业)为1个酶活性单位（U）。以标准D-半乳糖醛酸绘制标准曲线。试验反复3次。对照不加酶液，以缓冲液替换。

3.PME（果胶甲酯酶）酶活性：

取2g果肉，加3mL预冷1mol/LNaCl和2gPVP（聚乙烯基吡咯烷酮）置于研钵中，充足研磨后，转移到离心管中，再用2mLNaCl润洗，倒入离心管中，于冰浴中放置1小时，每隔20min震荡一次，在4℃下，10000转离心30min，搜集上清液，用0.01mol/LNaOH调至pH为7.5,于4℃保留备用。测定：在试管中依次加入1.5mL0.5%(w/v)果胶放冰箱备用，使用期5天、0.5mL0.01%溴麝香酚兰指示剂棕色瓶(pH为7.5)，1.0mL水，0.5mL酶液（酶液最终加入），总反应体系为3.5mL。立即将试管放入37℃水浴锅中30