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RNA干扰载体的构建的实验流程

RNA干扰载体重要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验一方面是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。

产品技术背景

pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA通过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。

pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中具有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达克制后的细胞功能和生理现象进行观测和分析。

插入寡核苷酸设计

pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目的基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。

合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游对的的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。

1.?选择干扰序列

在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：

推荐长度为19nt，采用21nt序列也可以取得良好效果。

RNA干扰序列中不包含大于3nt的连续相同碱基。

RNA干扰序列的GC含量为低到中档水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。

不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。

保证RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。

方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。

设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可认为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些原则不能保证设计的RNA干扰序列对目的基因有好的克制效果。针对一个目的基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。

2.?寡核苷酸设计。

（1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。

a)5’TCGACCC

b)19nt干扰序列正向序列(与目的mRNA一致)。

c)TTCAAGAGA(环状结构)。

d)19nt干扰序列的反向互补序列。

e)TTTTT。

（2）设计反义寡核苷酸链(5’-3’方向)。

a)去掉正义链寡核苷酸中5’TCGA

b)将环节a)中得到的序列做反向互补。

c)在环节b)中得到的序列的5’端加上碱基GATC。

一个设计好的例子见下图：

实验流程

概述：

以下为使用pRI载体的方法概述。

1.?将合成的正义和反义寡核苷酸链退火。

2.?用BglII和XhoI双酶切载体。

3.?将退火的寡核苷酸链与酶切后的线性载体连接。

4.?连接产物转化大肠杆菌。

5.?转染细胞。

6.?观测荧光表达(具有GFP的载体)或筛选稳定表达细胞(具有抗性的载体)。

7.?检测目的基因蛋白或mRNA表达水平

载体构建

对于实验中的很多环节，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等环节，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。

环节1：退火寡核苷酸链

根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，假如您连接和克隆碰到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他供应商提供的引物。

用水将寡核苷酸稀释为100μM。按以下体系配制退火反映体系：

正义寡核苷酸(100μM)5μl

反义寡核苷酸(100μM)5μl

NaCl100mM

Tris-ClpH7.450mM

加水补足50μl

将配制好的退火反映缓冲液反复混合，短暂离心后放置PCR以上，运营以下程序：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20℃长期保存。

环节2：酶切载体

用XhoI和BglII双酶切2μg载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。

通常情况下用大约20-30单位的酶在大约3小时可