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PCR常见问题2.非特异性扩增引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多PCR常见问题3.拖尾模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多循环次数过多M12PCR常见问题4.假阳性交叉污染操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；防止PCR产物污染各种试剂先进行分装，低温贮存。设置阳性和阴性对照，重复实验以RNA为模板，先逆转录为cDNA,然后再进行PCR反应利用内参法分析目的基因表达量的情况由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。RT-PCR（反转录PCR）一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法PCR的高效扩增特性核酸探针的高特异性光谱技术的高灵敏性和可计量性Real-timePCR（实时荧光定量PCR)荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针荧光染料TaqMan荧光探针原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。http://ipd.pps.tv/play_33K8AW.html?qq-pf-to=pcqq.c2cTaqMan荧光探针特点优点模板每复制１次，就有１个探针被切断，并有１个荧光信号被释放。被释放的荧光基团数和ＰＣＲ产物数是一对一的关系光密度同被释放的荧光基团数也呈正比关系可对模板进行准确定量。不足由于采用荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以彻底，本底较高。报告基团的水解利用的是Ｔａｑ酶的５’一３’外切活性，因此定量时容易受酶活性影响。探针标记成本较高Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。定量原理PCR原理模板DNA95℃高温变性/genetics/PCR/PCR.htm55℃引物1引物2DNA引物低温退火引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶中温延伸第1轮结束95℃第2轮开始高温变性PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增标准的PCR反应体系n×扩增缓冲液

4种dNTP混合物

TaqDNA聚合酶

Mg2+

双蒸水引物

模板DNA混合液试剂公司合成DNAcDNAPCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将